ThRAP2.1与ThADH1互作调控落羽杉杂种淹水胁迫响应的分子机制

本研究针对木本植物淹水胁迫响应机制不明的科学问题，通过酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(BiFC)技术，首次鉴定出落羽杉杂种'中山杉406'中乙醇脱氢酶1(ThADH1)的关键互作蛋白ThRAP2.1（AP2/ERF家族转录因子）。研究发现ThRAP2.1过表达能显著提高杨树耐淹性，通过激活ACC合成酶(ACS)和ADH活性，上调ThADH1表达，为木本植物耐涝分子育种提供新靶点。

　　

当洪水淹没农田林地时，植物面临的最大挑战是缺氧。与动物不同，植物无法逃离水淹环境，只能通过代谢重组来适应。其中，乙醇发酵通路成为关键生存策略——通过乙醇脱氢酶(ADH)将有毒的乙醛转化为乙醇，同时再生NAD⁺维持糖酵解供能。虽然草本植物如水稻的耐涝机制已有较多研究，但长期耐淹的木本植物如落羽杉（可耐受长达1年水淹）的分子机制仍是未解之谜。

中国科学院植物研究所的研究团队以具有卓越耐涝性的落羽杉杂种'中山杉406'为材料，发现其乙醇脱氢酶基因ThADH1在淹水胁迫中起核心作用。为揭示其调控网络，研究人员通过构建淹水胁迫下的cDNA文库，结合酵母双杂交筛选，首次在木本植物中发现ThADH1与乙烯响应因子ThRAP2.1存在直接互作。相关成果发表在《International Journal of Biological Macromolecules》，为解析木本植物耐涝机制提供了突破性进展。

关键技术方法
研究采用Gateway技术构建淹水胁迫下的标准化cDNA文库（库容1.60×10⁷，重组率100%），通过酵母双杂交(Y2H)筛选ThADH1互作蛋白，利用双分子荧光互补(BiFC)验证关键互作。以两年生'中山杉406'扦插苗为材料，设置0-50天梯度淹水实验，采用qPCR检测基因表达，通过农杆菌介导转化获得ThRAP2.1过表达杨株，测定ACC含量、ACS和ADH酶活等生理指标。

研究结果

植物材料
选用耐涝表型显著的落羽杉杂交种'中山杉406'（母本墨西哥落羽杉×父本落羽杉）两年生扦插苗，在20.5°C平均温度下进行梯度淹水实验。

cDNA文库与诱饵载体构建
建立的Gateway核系统酵母文库插入片段>1000bp，成功克隆ThADH1全长编码序列至pGBKT7载体，经自激活验证适合Y2H筛选。

ThADH1与ThRAP2.1的互作
从9个候选互作蛋白中鉴定出AP2/ERF家族转录因子ThRAP2.1。BiFC实验显示两者在烟草表皮细胞核中形成明显黄色荧光信号，证实体内互作。

表达模式与功能验证
• 时空表达：淹水50天内，ThRAP2.1在根、茎、叶中的表达持续上升，与ThADH1协同响应
• 表型分析：过表达ThRAP2.1的杨树在淹水后存活率提高47%，不定根数量增加2.3倍
• 机制解析：转基因株系ACC含量提升82%，ACS活性增强1.5倍，ADH活性提高2.1倍，且ThADH1表达量上调3.8倍

结论与意义
该研究首次在木本植物中建立ADH与ERF转录因子的功能关联，揭示ThRAP2.1通过三重调控增强耐涝性：
1）激活乙烯合成通路（ACC-ACS），启动胁迫信号传导
2）直接上调ThADH1表达，强化乙醇发酵产能
3）协同维持NAD⁺/NADH平衡，保障缺氧条件下能量供应

这一发现不仅填补了木本植物淹水响应机制的理论空白，更创新性地提出"转录因子-关键酶"双靶点调控策略，为选育耐涝林木品种提供了ThRAP2.1/ThADH1这一对分子标记。研究建立的酵母文库筛选体系，也为其他木本植物逆境互作蛋白研究提供了技术范式。