Glu720位点突变对黑曲霉NCIM 1400来源转糖基化α-葡萄糖苷酶功能调控机制的研究及其工业应用价值

本研究针对工业制备异麦芽低聚糖(IMO)的关键酶——转糖基化α-葡萄糖苷酶(tAG)，通过理性设计将Glu720突变为酪氨酸(E720Y)，使酶比水解活性提升1.9倍，热稳定性提高11%，45天储存稳定性在4℃和30℃下分别保持71.6%和63%活性。圆二色谱(CD)和分子动力学(MD)模拟证实该突变通过增加α-螺旋含量微调二级结构，最终使IMO产量从0.29 g/g提升至0.38 g/g，为功能性寡糖工业化生产提供优质酶资源。

　　

研究背景
功能性寡糖作为"肠道健康卫士"近年来备受关注，其中异麦芽低聚糖(IMO)因其缓慢消化特性，在调节血糖、增强矿物质吸收等方面展现出独特优势。工业上主要通过转糖基化α-葡萄糖苷酶(tAG)催化麦芽糖合成IMO，但天然酶存在水解活性主导、稳定性不足等瓶颈。黑曲霉(Aspergillus neoniger)NCIM 1400来源的tAG在+1/+2亚位点存在关键残基Glu720，其与底物识别机制尚不明确，这成为提升酶催化效率的重要突破口。

关键技术方法
研究人员采用I-TASSER构建野生型(wtAG)和突变体同源模型，通过TM-align程序比对PDB数据库确定3lppA(蔗糖酶-异麦芽糖酶)为最佳模板。设计E720F/L/Y/D/H/K/A七种突变体，采用圆二色谱(CD)分析二级结构变化，稳态荧光检测三级结构变化，结合分子动力学(MD)模拟阐释构效关系。酶活测定采用PNPG法，IMO产量通过HPLC定量。

研究结果
分子对接研究
E720Y突变导致活性中心构象重排，与底物形成π-π堆积作用，这是其转糖基化活性提升的结构基础。

结果与讨论

1. 突变体筛选：仅E720Y保持活性，其他突变体在SDS-PAGE中无蛋白条带，表明Glu720对酶折叠至关重要。
2. 酶学特性：E720Y比活达(28.7±0.8) U/mg，较wtAG(15.2±0.5) U/mg提升89%，其半衰期(T₅₀)在60℃延长11%。
3. 结构分析：CD显示α-螺旋含量增加3.2%，无规卷曲减少2.1%；荧光光谱最大发射波长保持338 nm，证实三级结构完整性。
4. 工业应用：E720Y在模拟工业条件下(30℃, pH5.0)连续使用10批次后仍保留82%活性。

结论
该研究首次揭示Glu720在tAG催化中的双重作用：既是维持酶结构的关键"分子铰链"，又是调控水解/转糖基化平衡的"分子开关"。E720Y通过优化活性中心疏水环境，使IMO产率提升31%，为设计"低水解-高转糖基"工业酶提供新策略。研究结果发表于《International Journal of Biological Macromolecules》，通讯作者Sarma Mutturi团队来自印度科学与工业研究委员会-中央食品技术研究所(CSIR-CFTRI)。