泰国孢子丝菌临床分离株的长读长测序分析与抗真菌药敏谱研究揭示钙调蛋白基因在物种鉴定和系统发育分析中的优势

这篇研究通过牛津纳米孔测序技术(ONT)对泰国人源和猫源孢子丝菌(Sporothrix)分离株的钙调蛋白(calmodulin)和ITS区域进行测序分析，发现钙调蛋白基因比传统ITS区域具有更高的物种鉴别力，成功将26株临床分离株鉴定为申克孢子丝菌严格种(S. schenckii sensu stricto)，并揭示其与东南亚菌株的系统发育关联。研究同时发现31%分离株对伊曲康唑(ITC)呈现升高的最低抑菌浓度(MIC)，为东南亚地区孢子丝菌病的分子诊断和临床治疗提供了重要依据。

　　

引言
孢子丝菌属(Sporothrix)是一类具有温度依赖性双相性的真菌，其临床相关种包括申克孢子丝菌严格种(S. schenckii sensu stricto)、巴西孢子丝菌(S. brasiliensis)、球形孢子丝菌(S. globosa)和卢里孢子丝菌(S. luriei)。传统形态学鉴定难以区分这些物种，需依赖分子技术。虽然核糖体ITS区域是真菌通用条形码，但钙调蛋白基因(外显子3-5)被提议为孢子丝菌物种鉴定的金标准。本研究采用牛津纳米孔技术(ONT)对泰国人源和猫源分离株进行长读长测序，评估其在物种鉴定和系统发育分析中的应用价值。

材料与方法
研究获得朱拉隆功大学医学院伦理委员会批准(IRB COA 0677/66)，收集2022-2023年间26例临床分离株（18例猫源，8例人源）。通过PDA培养基培养后，使用Maxwell RSC全血DNA试剂盒提取DNA，分别扩增钙调蛋白和ITS区域。建库采用ONT连接测序试剂盒，使用MinION R9.4.1流动槽进行测序。数据分析采用两种聚类算法：基于序列同源性的VSEARCH（相似度阈值99%）和基于k-mer频率的UMAP-HDBSCAN。同时进行Sanger测序验证和抗真菌药敏试验（CLSI M27-A2标准）。

结果
测序数据分析显示，VSEARCH聚类产生345-645个（钙调蛋白）和6-740个（ITS）簇，而UMAP-HDBSCAN仅产生1-5个和1-9个簇。所有分离株的钙调蛋白序列均被鉴定为申克孢子丝菌严格种，而ITS序列在部分分离株中出现物种鉴定不一致。系统发育分析将泰国分离株归入申克孢子丝菌严格种的亚分支I，与马来西亚、日本和美国的菌株聚为一簇，显示出明显的地理关联性。

抗真菌药敏试验显示，8/26分离株对伊曲康唑呈现升高的MIC值（>2 μg/mL），氟康唑(FLC)的MIC范围达32->256 μg/mL。两性霉素B(AMB)、泊沙康唑(POS)和伏立康唑(VRC)的MIC₉₀分别为4 μg/mL、1 μg/mL和2 μg/mL。

讨论
研究证实ONT长读长测序结合UMAP-HDBSCAN聚类可有效校正测序错误，钙调蛋白基因在物种鉴定中显著优于ITS区域。系统发育分析揭示泰国分离株属于特定的东南亚谱系，提示可能存在区域性传播克隆。抗真菌药敏结果显示伊曲康唑MIC升高的分离株比例高于既往报道，可能与基因组可塑性相关。该研究为孢子丝菌病的分子流行病学研究和临床治疗决策提供了重要数据支持。