整合ATAC-seq与RNA-seq技术解析二花脸与巴马香猪乳腺基板差异揭示猪乳头数变异的候选基因

本研究通过整合ATAC-seq和RNA-seq技术，首次绘制了26日龄胚胎期二花脸猪（平均20乳头）与巴马香猪（平均10乳头）乳腺基板的染色质开放图谱与基因表达谱。研究发现乳腺基板染色质开放区域（OCR）在品种间高度保守（仅30个差异OCR），但鉴定出4432个差异表达基因，包括WNT通路关键基因WNT10B/WNT6。多组学联合分析锁定SSC14染色体48.80 Mb区域的三个候选基因（ENSSSCG00000031037/32042/39180），荧光原位杂交（FISH）证实ENSSSCG00000031037在乳腺基板上皮细胞特异性表达，选择信号分析显示该区域在二花脸猪中受强烈选择。研究为解析猪乳头数变异的表观遗传机制提供了新见解。

　　

染色质开放图谱揭示乳腺基板发育的保守性
通过ATAC-seq技术对26日龄猪胚胎乳腺基板进行分析，发现30,806个开放染色质区域（OCR）广泛分布于18条常染色体和X染色体。这些OCR主要富集在基因间区（33.25%）和启动子区（31.31%），并与463个已知乳头数相关QTL区间显著重叠。值得注意的是，尽管二花脸猪（平均20乳头）与巴马香猪（平均10乳头）表型差异显著，但仅鉴定出30个品种特异性差异OCR，聚类分析未显示品种分层现象，提示乳腺基板染色质开放模式在猪种间高度保守。

转录组差异揭示关键发育通路
RNA-seq分析发现两品种间存在4432个差异表达基因（DEGs），其中3463个在二花脸猪中上调。这些DEGs显著富集于乳腺发育相关通路：WNT信号通路（FDR=1.89E-05）中WNT10B/WNT6表达差异显著；Notch通路（FDR=9.33E-03）的NOTCH4参与上皮-间质互作；TGF-β通路（FDR=2.35E-05）的BMP6调控乳腺干细胞微环境；PI3K-Akt通路（FDR=6.92E-12）中FGFR3/FGFR4影响上皮细胞增殖。这些发现与小鼠模型中报道的乳腺基板形成机制高度吻合。

多组学锁定SSC14关键候选基因
整合分析发现位于SSC14染色体48.80 Mb区域的三个相邻基因（ENSSSCG00000031037/32042/39180）在ATAC-seq和RNA-seq中均显示显著差异：其染色质可及性和表达水平在二花脸猪中均更高（如ENSSSCG00000031037的log₂FC=2.87）。表型全基因组关联分析（pheWAS）显示这些基因与杜洛克/长白/约克夏混合群体的乳头数显著相关（p<5.47E-06）。荧光原位杂交证实ENSSSCG00000031037特异性表达于乳腺基板上皮细胞，与乳腺发育的时空特异性相符。

选择压力塑造高乳头数表型
连锁不平衡（LD）分析显示该基因组区域在两品种中均呈现异常高LD（r²_0.3>500 kb）。选择信号检测发现二花脸猪在该区域具有更强选择信号：iHS值达5.96（巴马香猪仅>2），XP-EHH分析证实该区域在二花脸猪中受正向选择。Tajima's D值（3.10）提示平衡选择作用，可能与人工选育高繁殖力性状相关。这些发现从群体遗传学角度解释了二花脸猪极端表型的形成机制。

技术突破与育种启示
该研究首次建立猪乳腺基板多组学分析体系，突破传统GWAS难以定位因果基因的局限。发现的候选基因区域不仅在中国地方猪种中发挥作用，在西方商业猪种中同样显示显著关联，表明其跨品种调控乳头数的保守功能。未来可通过基因编辑验证这些候选基因的功能，为分子标记辅助选择提供靶点，最终提升母猪哺乳能力和仔猪存活率。研究策略也为其他家畜复杂性状的机制解析提供了范式。