转酮醇酶过表达缓解xylA抑制并促进酿酒酵母混合糖发酵中的木糖利用

本研究通过过表达转酮醇酶基因(TKL1)优化酿酒酵母(S. cerevisiae)的木糖代谢途径，在混合糖发酵中实现木糖利用率提升52.4%，乙醇转化率达0.43 g/g（理论值93.5%）。qPCR证实TKL1过表达可解除木酮糖积累对木糖异构酶(xylA)的反馈抑制，为木质纤维素生物炼制提供了高效菌株构建策略。

　　

代谢工程改造酿酒酵母的木糖利用途径

ABSTRACT
代谢工程改造的酿酒酵母虽已具备木糖发酵能力，但木糖生物利用度仍是制约木质纤维素经济性的核心瓶颈。研究聚焦戊糖磷酸途径关键酶转酮醇酶(TKL1)的过表达效应，发现重组菌株INVSc-xylA-Xltr1p-TKL1在有机氮源混合糖培养基中木糖消耗量达3.01 g/L，较对照提升16.2%。qPCR显示该菌株xylA基因表达量翻倍，证实TKL1过表达可缓解木酮糖积累导致的xylA抑制。

1 Introduction
木质纤维素水解液含30%-40%木糖，但传统微生物难以直接代谢。细菌通过木糖异构酶(XI)途径代谢木糖，而真菌依赖木糖还原酶(XR)-木糖醇脱氢酶(XDH)途径，后者存在NADPH/NADH辅因子失衡问题。XI途径虽无辅因子限制，但受碳分解代谢抑制(CCR)和木酮糖积累抑制。戊糖磷酸途径(PPP)是木糖进入中心碳代谢的关键入口，其中转酮醇酶(TKL)催化核酮糖-5-磷酸等底物转化为木酮糖-5-磷酸等产物。前期研究表明，过表达非氧化PPP基因可使工程菌株木糖生长速率提高30倍。

2 Materials and Methods
使用尿嘧啶缺陷型二倍体酿酒酵母INVSc为宿主，构建重组质粒PUMRI-A-xylA-TKL1。通过电转化将线性化DNA片段导入酵母，在SD-FOA培养基筛选标记基因剔除菌株。采用HPLC（安捷伦1260 Infinity II）定量发酵液中的木糖、葡萄糖和乙醇，流动相为5 mM硫酸，流速0.5 mL/min。实时荧光定量PCR以ACT1为内参基因，采用2^-ΔΔCt法分析xylA表达量。

3 Results
3.1 工程菌株构建与筛选
成功获得标记基因剔除菌株INVSc-E2-4和INVSc-E2-7，其在SC-URA平板上生长被完全抑制（OD₆₀₀从3.43降至0.053）。基因组PCR验证显示5502 bp和2732 bp特征条带，证实TKL1基因正确整合。

3.2 TKL1对木糖异构酶表达的调控
qPCR显示INVSc-xylA-Xltr1p-TKL1中xylA表达量较对照提升2倍（p<0.001），表明TKL1过表达通过减少木酮糖积累缓解了xylA抑制。

3.3 工程菌株生长与发酵特性
在有机氮源YPDX培养基中，重组菌株生物量（OD₆₀₀=14.72）显著高于无机氮源SCDX培养基（OD₆₀₀=8.75）。混合糖培养时，葡萄糖存在使木糖利用率提升16%，显示碳源协同效应。

3.4 TKL1强化促进木糖利用
有机氮源条件下，重组菌株在YPX和YPDX培养基中木糖消耗量分别达1.54 g/L和3.01 g/L，较对照提升52.4%和16.2%。无机氮源时对应提升13%和24.5%，显示氮源类型显著影响代谢效率。

3.5 产物转化效率提升
重组菌株在YPDX培养基中8小时达到乙醇峰值1.87 g/L，转化率0.43 g/g，对应木糖理论转化率93.5%。120小时木糖利用率达37.5%，较对照提升33%。

4 Discussion
研究首次揭示TKL1通过双重机制提升木糖代谢：既加速木酮糖-5-磷酸通量，又通过解除xylA抑制重塑代谢网络。与Kobayashi等报道的1.03 g·L^-1·h^-1乙醇产率相比，本研究的糖醇转化效率更具优势。氮源类型对代谢效率的影响提示工业发酵需优化培养基组成。

5 Conclusion
构建的INVSc-xylA-Xltr1p-TKL1工程菌株通过TKL1-xylA协同调控，实现混合糖发酵中木糖利用率提升54%，乙醇理论得率达93.5%。该策略为木质纤维素生物炼制提供了具有工业化潜力的微生物底盘。