质粒毒力岛遗传多样性决定密歇根棒杆菌致病适应性

本研究通过对88株密歇根棒杆菌（Clavibacter michiganensis）田间分离株的表型与基因组分析，首次系统性揭示11种质粒类型（含9个新质粒）的遗传多样性及其在致病中的核心作用。关键发现包括：① 质粒携带的毒力基因岛GIα（含celA）与GIβ（含pat-1）的共存决定番茄萎蔫症状；② 新型接合质粒pCM5携带染色体毒力基因chpG的复制体，增强病原适应性；③ 水平基因转移（HGT）驱动质粒重组，导致9株菌株在烟草中丧失毒力。该研究为植物病原菌进化机制提供了范式级见解。

　　

专业性内容归纳

引言

细菌通过质粒等移动遗传元件（MGEs）获得毒力基因以实现环境适应。革兰氏阳性植物病原菌密歇根棒杆菌（Clavibacter michiganensis）的质粒携带关键毒力基因celA（纤维素酶）和pat-1（丝氨酸蛋白酶），二者是诱发番茄萎蔫的核心因子。尽管染色体毒力岛（PAI）参与致病，质粒基因对症状发展的贡献更显著。当前研究缺乏基于完整基因组的高分辨率分析，限制了对其进化机制的理解。

材料与方法

菌株与培养：2011–2020年从韩国番茄田中分离88株菌株，以LMG7333^T标准株为对照。
毒力测定：采用根部侵染法接种番茄及本氏烟草（Nicotiana benthamiana），评估萎蔫症状（0–5级）。
基因操作：通过电穿孔将celA/pat-1导入缺失株。
基因组分析：PacBio测序25株关键菌株，通过OrthoFinder进行系统基因组树构建，COPLA算法预测质粒分类单元（PTUs），并利用ICEfinder鉴定MGEs。

结果

表型特征分析
88株菌分为系统发育群1（59株）和群2（29株）。4株菌（12030、12032、19249-1、20011-1）因缺失celA和/或pat-1丧失纤维素酶活性及番茄萎蔫诱导能力。互补实验证实双基因共存为萎呮必需（图2）。9株菌在本氏烟草中无毒性，提示存在宿主特异性毒力因子。

质粒多样性驱动致病分化
基因组解析揭示11种质粒（pCM1–pCM11），大小26–109 kb：

• 毒力质粒：pCM7（59 kb, 54株）、pCM10（75 kb）、pCM11（109 kb）携带GIα（含celA）和GIβ（含pat-1），二者通过重组酶/转座酶相连（图6–7）。
• 新型接合质粒pCM5（49 kb）：含MOB_C松弛酶、T4SS及染色体毒力基因chpG复制体，菌落呈亮黄色且纤维素酶活性增强（图S11b）。
• 非毒力质粒：pCM3–pCM6/pCM8–pCM9与其他质粒同源性<30%，PTU分类表明均为新质粒类型（表S10）。

88株菌按质粒组合分为10类，pCM7为优势质粒（61.4%）。时空分布显示pCM5相关组合在2018年后显著增加（图4d）。

毒力岛动态进化
GIα（13.1 kb）和GIβ（23.5 kb）含附加毒力基因（如ppaJ、phpA/B）及毒素-抗毒素系统（AbiEii/Gii）。pCM10与智利株VL527的pVL1同源性达98.9%，pCM9与白俄罗斯株pCM-NP1完全一致，表明毒力岛跨洲传播。截短型GIβ（缺失phpA/B）见于pCM2/pCM9，反映持续退化（图7）。

质粒-染色体互作
pCM5菌株染色体较其他组长11 kb，该片段与Rathayibacter tanaceti同源（99%），提示HGT事件（图S12）。毒力基因谱显示8株菌中染色体假基因chpA/B/D、sbtA恢复功能（图8）。

讨论

质粒重组主导密歇根棒杆菌的毒力进化：

1. GIα/GIβ协同机制：双毒力岛通过MGEs（转座酶/TA系统）稳定遗传，其水平转移致pCM10–pCM11形成。
2. 质粒接合潜能：MOB_F（大质粒）和MOB_C（中质粒）介导基因流动，pCM5含完整接合模块，可能驱动chpG基因复制。
3. 生态适应性：pCM7的长期流行反映其结构稳定性，而pCM5近年扩散可能与宿主适应性相关（如增强纤维素降解能力）。

本氏烟草毒性缺