综述：重组蛋白和小分子从本氏烟草生物质中纯化的下游工艺开发

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【字体：大中小】 时间：2025年07月01日 来源：Plant Biotechnology Journal 10.5

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　　这篇综述系统探讨了本氏烟草(Nicotiana benthamiana)作为重组蛋白生产宿主的DSP（下游工艺）优化策略，重点分析了从生物质收获、产品提取、澄清到纯化的全流程技术方案，特别强调了热沉淀、膜过滤和色谱分离等关键单元操作在提高产物纯度(>95%)和收率方面的应用潜力，为植物分子农业(PMF)的产业化提供了重要参考。

生物制药领域近年来在植物表达系统方面取得重大突破，其中澳大利亚烟草(Nicotiana benthamiana)凭借其快速生长特性和兼容瞬时表达的优势，已成为重组蛋白生产的明星宿主。特别是在2023年首个植物源人用药物获批后，该系统的产业化潜力备受关注。然而要实现商业化生产，下游处理工艺的优化仍是关键瓶颈。

生物质特性决定工艺路线
本氏烟草的生物质组成直接影响下游处理策略。研究表明，叶片中重组蛋白含量显著高于茎部（茎部占比可达25%），选择性采收可有效降低处理体积。培养条件也至关重要：黑暗处理24小时能使叶绿素b减少50%，而37°C热激可使蛋白表达量提升5倍。值得注意的是，1kg鲜重生物质约相当于1L生物反应器的干物质含量，这为规模放大提供了换算基准。

高效采收与提取技术
自动化采收设备如旋转圆盘刀已实现规模化应用，相比人工采收更符合GMP要求。提取方法中，机械破碎（珠磨机、螺旋压榨）比冻融法更具经济性，后者每公斤生物质需额外增加5€/g成本。缓冲液配方优化可显著提高收率：添加10mM亚硫酸钠能防止多酚氧化，而电导率提升至1.0 S·m^-1可使疟疾疫苗候选物的溶解度倍增。引人注目的是，螺旋压榨技术无需缓冲液即可同步实现固液分离，处理能力可达100kg/h。

创新澄清策略
针对高颗粒负荷（200g/L）的提取液，多级过滤组合展现优势：鼓式过滤器可连续处理5-10μm颗粒，而深层过滤器能捕获0.1-20μm杂质。特别发现，虽然IgG₁在深度过滤中回收率达95%，但IgG₃和抗体融合蛋白却可能因与硅藻土相互作用损失50-80%。新型玻璃纤维过滤器为解决这一难题提供了替代方案。

膜技术的突破应用
超滤/透析(UF/DF)系统展现出独特优势：100kDa膜可截留550kDa的RuBisCO寡聚体，同时使11kDa的抗HIV蛋白氰病毒素-N透过率达60%。更令人振奋的是，单程切向流过滤系统实现了连续操作，配合1.2μm膜对蛛丝蛋白-弹性蛋白融合体的截留，使纯度提升至50%。

色谱纯化进展
组氨酸标签(His-tag)仍是IMAC纯化的主流选择，但植物源植酸(1-10g/kg)可能螯合固定化金属离子。Protein A层析已成功应用于200kg规模的单抗生产，而新兴的纤维色谱技术可直接处理含颗粒料液，有望简化前处理流程。自切割标签系统如CASPON的出现，则解决了标签去除导致的免疫原性隐患。

未来发展方向
计算机辅助设计工具CADET可通过机理建模优化分离参数，大幅减少实验筛选工作量。连续生产工艺的整合成为趋势，特别是将螺旋压榨、在线膜浓缩和纤维色谱串联的操作模式。虽然DSP成本已从早期占80%降至55%，但通过选择性采收、热沉淀(80% HCP去除率)等创新工艺，仍有进一步优化空间。

随着垂直农场等新型栽培模式的应用，本氏烟草表达系统正朝着标准化、自动化方向发展。尽管在产物滴度（目前<1g/kg）方面仍逊于CHO细胞(>5g/L)，但其快速响应优势（基因到产物仅需数周）使其在疫情应对等特殊场景独具竞争力。未来需要更多针对非平台产品（如细胞因子）的纯化方案研究，以拓展植物分子农业的应用疆域。

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