姜黄与甘草联合提取物对橄榄比目鱼病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的抗病毒功效研究

本研究通过体外和体内实验证实，姜黄（Curcuma longa）与甘草（Glycyrrhiza uralensis）联合提取物（TLex）可显著抑制病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的复制，其半数有效浓度（EC50）为149.4±2.34 μg/mL，选择性指数（SI）达52.9。口服TLex（≥3.2 μL/鱼/天）可上调干扰素相关基因（Mx、ISG15、IRF3/8），使橄榄比目鱼相对存活率（RPS）提升42.9%-100%，为水产养殖抗病毒策略提供新方案。

　　

摘要

姜黄与甘草联合提取物（TLex）在体外实验中表现出低细胞毒性（CC₅₀：7903.08±6.26 μg/mL）和强抗VHSV活性（EC₅₀：149.4±2.34 μg/mL）。斑块减少实验显示，病毒暴露后给药效果最佳，抑制率高达100%。TLex（133.4 μg/mL）可上调HINAE细胞中Mx、ISG15、IRF3和IRF8基因表达。体内试验中，口服TLex（3.2-207.9 μL/鱼/天）使橄榄比目鱼在VHSV攻击下的相对存活率（RPS）达35.7%-50%，田间试验中RPS进一步提升至25%-100%。

1 引言

病毒性出血性败血症（VHS）是橄榄比目鱼养殖业的主要威胁，其病原体VHSV在8°C-15°C水温中致病性最强。尽管商业化疫苗已部分缓解问题，但注射方式限制其在小鱼中的应用。姜黄中的姜黄素（curcumin）和甘草中的甘草酸（glycyrrhizin）具有广谱抗病毒特性，前者可抑制虹彩病毒和VHSV，后者对新城疫病毒（NDV）和SARS-CoV-2有效。两者联用可能通过协同作用增强疗效，本研究系统评估了TLex的抗VHSV潜力。

2 材料与方法

2.1 提取物制备
TLex含12 g/L甘草酸和0.72 g/L姜黄素，通过微波辅助提取法制备。LC-MS/MS验证其成分，方法验证显示线性（R²>0.999）、精密度（RSD<10%）和准确度（75%-100.9%）符合要求。

2.2 抗病毒机制研究
采用HINAE细胞系进行：

• 细胞毒性：中性红染色法测定CC₅₀
• 抗病毒活性：Reed-Muench法计算EC₅₀，SI=CC₅₀/EC₅₀
• 斑块实验：共暴露、预暴露和后暴露三种处理方式
• 免疫基因表达：qRT-PCR检测Mx、ISG15等干扰素通路基因

2.3 体内试验设计

• 实验室试验：分两阶段（2周和6周）口服TLex后腹腔注射VHSV（10^7.1 TCID₅₀/鱼）
• 田间试验：在济州岛和莞岛养殖场投喂含TLex（30 μL/克饲料）的饵料38-35天

3 结果

3.1 体外活性
TLex的SI值为52.9，后暴露处理在222.4 μg/mL时完全抑制病毒斑块形成（100%）。133.4 μg/mL TLex处理24小时使IRF8表达量提升2.3倍。

3.2 体内保护效果

• 实验室试验：3.2 μL/鱼/天剂量组2周RPS达50%（p<0.001）
• 田间试验：济州岛养殖场RPS达100%（10^6.8 TCID₅₀/鱼攻击）

3.3 安全性
6周喂养后，血清AST/ALT水平和组织病理学未见异常。

4 讨论

TLex的抗病毒机制可能涉及：

1. 直接病毒抑制：甘草酸干扰病毒包膜融合
2. 免疫调节：姜黄素激活IRF3/7通路
3. 剂量阈值效应：超过3.2 μL/鱼/天时RPS不再显著提升，可能与化合物低生物利用度有关

该研究为水产养殖业提供了一种可替代注射疫苗的天然抗病毒方案，未来需进一步优化制剂以提高生物利用度。