综述：等温扩增技术联合CRISPR/Cas系统的最新进展

这篇综述系统阐述了等温扩增(IA)技术与CRISPR/Cas系统协同应用的突破性进展，重点介绍了RCA/LAMP/RPA/SDA/HCR/CHA等IA技术与Cas9/Cas12/Cas13/Cas14系统的耦合策略，及其在即时检测(POCT)、微流控平台和纳米传感器等分子诊断领域的创新应用，为解决传统方法在资源有限环境下面临的灵敏度-特异性平衡难题提供了新思路。

　　

等温扩增技术与CRISPR/Cas系统的革命性联姻

2 OVERVIEW OF IA TECHNIQUES AND CRISPR/Cas SYSTEMS
等温扩增(IA)技术作为分子诊断领域的变革性工具，其发展历程可追溯至Guatelli等人在1990年代建立的自持序列复制(3SR)系统。从酶驱动的RCA、LAMP、RPA等技术，到无酶的HCR、CHA等创新方法，IA技术通过恒温条件实现核酸快速扩增，完美解决了传统PCR对精密温控设备的依赖。与此同时，源自原核生物免疫防御机制的CRISPR/Cas系统展现出惊人的基因编辑能力，其中Class 2系统的Cas9、Cas12、Cas13、Cas14等效应蛋白通过crRNA引导实现靶向切割，其附带切割(trans-cleavage)特性更成为信号放大的利器。

3 APPLICATIONS OF IA TECHNIQUES IN CRISPR/Cas SYSTEMS
3.1 RCA耦合CRISPR/Cas系统
滚环扩增(RCA)与CRISPR/Cas的联用创造了多项检测记录。Wang团队开发的RCA-assisted CRISPR/Cas9 cleavage平台通过padlock探针连接和PAM触发切割的双重识别机制，实现了细胞外囊泡miRNA的单碱基分辨率检测。Yan等开发的EXTRA-CRISPR技术将Cas12a的cis/trans切割活性巧妙结合，使胰腺导管腺癌相关miRNA的检测限达到个位数fM水平，且支持智能手机荧光读取。

3.2 LAMP耦合CRISPR/Cas系统
环介导等温扩增(LAMP)与CRISPR的联用展现出强大的现场检测潜力。Ma团队开发的SCENT-Cas平台通过Cas12a触发银纳米簇荧光转换，实现了伤寒沙门氏菌1 CFU/mL的超敏检测。TB-Quick技术整合LAMP与Cas12b，可在2小时内检出1.3拷贝/μL的结核分枝杆菌DNA，为资源有限地区提供了高效解决方案。

3.3 RPA耦合CRISPR/Cas系统
重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR的联姻催生了多项突破性技术。Gootenberg开发的SHERLOCK系统利用Cas13a的附带RNA酶活性，实现了寨卡病毒2.1 aM的检测灵敏度。Chen团队的DETECTR平台通过Cas12a激活，使人乳头瘤病毒(HPV)检测限达10 aM，为床旁检测树立了新标杆。

4 INTEGRATING IA WITH CRISPR/Cas SYSTEMS IN PERSONALIZED APPLICATIONS
4.1 POCT应用
即时检测领域涌现出诸多创新成果。sPAMC技术通过优化Cas12a的PAM识别序列，将SARS-CoV-2检测缩短至15分钟。SCOPE平台整合RPA-Cas13a系统，对猴痘病毒(MPXV)的检测灵敏度达0.5拷贝/μL，且无需复杂核酸提取步骤。

4.2 微流控应用
微流控技术与CRISPR的融合开创了数字化检测新范式。deCOViD平台通过亚纳升液滴分割，在15分钟内完成SARS-CoV-2的定性分析。DropCRISPR采用皮升级注射技术解决LAMP与Cas12a的温度兼容性问题，成功检测出10² CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌。

4.3 纳米传感器应用
纳米材料为CRISPR检测增添了新维度。Qiu团队设计的双功能纳米花(BFNzyme)耦合Cas12a，实现了沙门氏菌的双模式检测。三合一DNA水凝胶平台整合荧光-比色-拉曼检测，使诺如病毒的拉曼检测限达0.16 fM。

5 CONCLUSION AND PERSPECTIVES
尽管IA-CRISPR联用技术已取得显著进展，但仍面临反应效率优化、脱靶效应控制等技术挑战。未来发展方向包括开发多重检测方案、优化温度兼容性、提高系统稳定性等。随着精准医学时代的到来，这种"恒温扩增-精准识别"的创新模式必将为分子诊断带来革命性变革。