线粒体延迟发光技术优化阿尔茨海默病小鼠光生物调节治疗参数的机制研究

这篇研究通过测量脑组织线粒体延迟发光（m-DL）优化了光生物调节（PBM）治疗阿尔茨海默病（AD）小鼠的关键参数。研究发现，80 Hz频率结合30%占空比的近红外（NIR）照射可显著延长m-DL衰减时间，选择性改善识别记忆，并减少β-淀粉样蛋白（0.27倍）和小胶质细胞激活（0.13倍），同时保持神经元密度。研究为AD的非侵入性治疗提供了参数优化新策略。

　　

ABSTRACT
研究评估了光生物调节（PBM）对阿尔茨海默病（AD）的治疗潜力，通过分析β-淀粉样蛋白沉积、小胶质细胞激活和记忆功能。采用808 nm近红外光（2 J/cm²）照射麻醉的5XFAD小鼠暴露的脑表面，测量线粒体延迟发光（m-DL）作为间接线粒体标志物。基于m-DL结果，行为学PBM通过完整头皮透颅施加相同能量密度，分别在30、40和80 Hz频率及相应占空比和持续时间下进行。80 Hz设置产生最长的m-DL衰减时间，并选择性改善识别记忆。免疫荧光显示β-淀粉样蛋白显著减少0.27倍，小胶质细胞激活减少0.13倍，神经元密度无变化。局限性包括样本量小、持续时间短以及需要验证m-DL与既定生物能量测定法的相关性。尽管如此，研究结果表明优化的PBM可能为AD提供一种有前景的非侵入性干预措施，值得进一步长期研究。

1 Introduction
阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，以认知衰退、β-淀粉样斑块积累、神经炎症和最终神经元丢失为特征。目前AD治疗策略主要提供症状缓解，但无法有效改变或阻止潜在疾病病理。光生物调节（PBM）利用近红外光（NIR）显示出调节线粒体功能的潜力。NIR光子被细胞色素c氧化酶吸收后，引发细胞内事件，包括增强线粒体活性、减少氧化应激、神经保护以及调节细胞存活、增殖和修复相关的细胞信号通路。这些效应导致生物能量增加、活性氧（ROS）调节、神经炎症减少和神经修复。

先前研究在连续波模式下使用PBM治疗AD小鼠，报告了β-淀粉样蛋白负担减少和认知功能增强。脉冲波（PW）模式下的PBM应用，特别是40 Hz频率和不同占空比，显示出类似结果。40 Hz与γ频率神经元激活一致，与认知过程和淀粉样蛋白清除相关。外部γ频率刺激可增强神经元活性，促进淀粉样蛋白清除和减少神经炎症。PBM通过靶向线粒体功能和细胞能量代谢，可能与γ频率神经振荡协同减轻AD病理。

PW应用中，频率、占空比和能量密度等参数对调节细胞反应和治疗结果至关重要。10至100 Hz频率常用于AD治疗，40 Hz对β-淀粉样蛋白清除和认知表现最有效。占空比从10%到50%平衡能量输送与细胞恢复：较低占空比（20%-30%）防止过度刺激，较高占空比（50%）维持激活，可能增强淀粉样蛋白清除但需谨慎管理。典型能量密度为2-60 J/cm²，808和850 nm NIR因其深层组织穿透能力常用。治疗持续时间通常为60-1200秒，重复数周以获得累积效应。40 Hz与10%-50%占空比结合可能促进神经振荡、突触可塑性和线粒体功能，最大化AD中的神经保护效果。

然而，并非所有研究都报告一致阳性结果，部分研究显示40 Hz PBM治疗后AD相关参数无显著减少，表明PBM疗效存在变异性。这强调探索不同脉冲频率和占空比如何影响PBM反应的必要性，以及对潜在机制深入理解的迫切需求。为填补这一空白，引入线粒体延迟发光（m-DL）作为评估PBM线粒体和细胞反应的新指标。m-DL是光照射后光子延长发射现象，反映线粒体氧化还原状态和细胞内能量转移效率，特别是通过电子传递链中的细胞色素c氧化酶。m-DL衰减时间反映线粒体生物能量学，为细胞能量动力学提供独特视角，并有助于识别优化治疗反应的PBM参数。延长m-DL衰减时间与增强线粒体活性、减少氧化应激和持续能量产生相关，这对解决AD病理至关重要。

本研究旨在阐明PBM参数（如脉冲频率和占空比）变化如何影响AD病理，包括记忆功能、β-淀粉样蛋白积累、小胶质细胞激活和神经元密度，利用行为评估、免疫荧光分析和m-DL测量。优化PBM参数假设可显著增强其治疗效果，从而更精确和实际地应用PBM作为AD和其他神经退行性疾病的非侵入性治疗。

2 Materials and Methods
2.1 Animals
使用7周龄雄性5XFAD小鼠，共28只，购自Jackson Laboratory。5XFAD小鼠过表达携带瑞典（K670N, M671L）、佛罗里达（I716V）和伦敦（V717I）家族性AD突变的人β-淀粉样前体蛋白695，以及携带M146L和L286V突变的人早老素1。两种转基因均受小鼠Thy1启动子调控，驱动大脑过表达，使这些小鼠成为研究AD淀粉样病理、神经元内Aβ-42诱导的神经变性和淀粉样斑块形成的合适模型。

2.2 Mitochondrial Delayed Luminescence for Optimal PBM
为研究体内m-DL，选择8只3月龄雄性BALB/c小鼠。麻醉后手术切开头皮并移除颅骨暴露脑表面。将功率检测器（S130VC）直接置于暴露的脑部检测发射的m-DL。整个实验系统覆盖黑盒以阻挡外部光。所有m-DL测量在严格控制的黑暗条件下进行。NIR光源（808 nm，最大100 mW）激活以照射脑部指定时间后关闭。为诱导m-DL，激光开关占空比和频率分别设置为10%至100%（10%增量）和10至100 Hz（10 Hz增量），采用PW模式。检测器用于测量无NIR光时脑组织发射的m-DL。NIR强度通过衰减时间计算。

2.3 Experimental Design
基于m-DL结果进行照射。小鼠置于颈椎固定装置中保持不动，眼睛屏蔽，同时通过手机摄像头确认NIR激光斑在脑部位置。照射期间小鼠头部固定在颈椎固定装置中以减少运动。为减轻重复手动操作引起的应激，照射每周3天，共12周。激光和调制系统用于照射。实验时间表包括PBM治疗、行为测试和动物安乐死。

2.4 Behavioral Test
行为测试在三个关键时间点进行：PBM治疗前（第12周）、治疗中期（第19周）和研究结束时（第25周）。使用以下行为测试评估AD小鼠模型的认知功能和记忆：

2.4.1 Y-Maze Spontaneous Alternation Test
Y迷宫由透明丙烯酸板制成，Y形配置，每个臂宽10 cm，长41 cm，高25 cm。迷宫臂指定为区域A、B和C，测试间用70%乙醇清洁以消除嗅觉线索。测试小鼠随机放入一个臂（区域C），自由探索迷宫5分钟。记录进入臂次数（定义为小鼠四爪完全进入臂内）和交替次数（定义为连续进入三个不同臂，如A→B→C）。交替百分比通过公式计算。

2.4.2 Novel Object Recognition Test
新物体识别测试连续进行3天。测试场地为开放空间，所有物体由无孔材料制成，测试间用70%乙醇清洁。第1天，小鼠放入空场地自由探索5分钟以适应环境。第2天，场地引入两个相同物体（A + A），小鼠探索10分钟。记录探索每个物体时间（定义为小鼠鼻子指向物体2 cm半径内）。第3天，一个物体替换为新物体（A + B），小鼠再次探索10分钟。记录探索时间。

2.4.3 Passive Avoidance Test
被动回避测试连续进行2天，使用平台和暗室设置。暗室尺寸30 × 30 × 30 cm，铝格地板连接电刺激器以施加轻度足部电击。照明由灯提供（350 ± 5 lx），位于平台上方45 cm，平台边缘60 cm。第1天，小鼠置于实验室外平台，头部背向室入口。同时打开室门，灯亮1分钟。小鼠四爪进入暗室后关门，保持3秒。随后通过格栅地板施加0.5 mA足部电击2秒。监测小鼠对电击反应（畏缩、奔跑、跳跃和发声）。10秒后取出小鼠放回笼中休息至次日。第2天重复相同协议，但不施加足部电击。测量潜伏期（小鼠进入暗室所需时间）。

2.5 Immunofluorescence Assay
免疫荧光染色在6 μm冷冻切片脑组织上进行，聚焦AD关键受累区域皮层和海马。切片流水冲洗5分钟，蒸馏水冲洗5分钟。抗原修复使用70%甲酸20分钟（Iba-1和β-淀粉样蛋白染色）或pH 6.0柠檬酸盐缓冲液65°C热诱导16小时（NeuN染色）。切片TBST洗涤3次，每次5分钟。室温下用4%牛血清白蛋白TBST封闭非特异性结合30分钟。切片在湿盒中室温孵育3小时，使用以下一抗：Iba-1（1:200）、β-淀粉样蛋白（1:1000）或NeuN（1:2000）。孵育后TBST洗涤3次，每次5分钟。应用相应二抗30分钟：Iba-1用Alexa Fluor 488（1:500），β-淀粉样蛋白用Alexa Fluor 594（1:500），NeuN用Alexa Fluor 647（1:500）。最终TBST洗涤后，DAPI复染，抗褪色封片剂封片，避光保存。切片共聚焦显微镜成像。荧光强度用ImageJ软件定量，归一化至对照组，表示为倍数变化。

2.6 Statistical Analysis
数据表示为均值±标准差。采用单因素方差分析评估实验组间差异，