综述：用于解剖学的快速组织透明化和三维成像技术

本综述推荐组织透明化技术与三维成像方法的协同突破，推动解剖学研究进入亚细胞级三维时代。传统宽场显微术受限于薄切片样本，而体视学方法耗时且易失真。近25年发展的非线性显微术（如双光子2P）和光片显微术（LSFM）结合组织透明化技术（CLARITY/3DISCO等），实现全器官透明化与无物理切片的三维成像（3D），突破光学显微术四百年来的维度限制，为解剖病理学提供新视角。

　　

组织成像简史

解剖学从古代宏观描述演进至显微层面，但传统组织切片技术将三维结构压缩为二维信息。体视学通过序列切片重建三维结构，但存在物理切割伪影、染色失真和耗时等问题。现代医学影像（MRI/CT）实现器官级三维观察，但亚细胞级成像仍依赖薄切片（5-10μm），无法保留原始空间关系。

突破森林之障

组织不透明源于光散射与吸收。红光穿透性较好（如手指透光实验），但短波长光易被色素和线粒体吸收。散射使光子偏离原路径，导致成像模糊。解决方案包括两类：改进显微系统（如大数值孔径物镜提升分辨率和集光能力）和改变组织光学特性——此为组织透明化核心逻辑。

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组织透明化技术

透明化通过调控折射率（RI）匹配和去除吸光物质实现，分四大体系：

1. 有机溶剂法（如3DISCO）：
   • 脱水脱脂后浸入高RI溶液（RI≈1.55）
   • 优势：速度快（数天）、透明度高
   • 局限：组织收缩、荧光淬灭、有毒试剂
2. 高折射率水溶液（如TDE）：
   • 水溶性试剂调整RI（1.44-1.52）
   • 优势：保留脂质、低毒性
   • 局限：大样本透明效率低
3. 高水合溶液（如CUBIC）：
   • 尿素-去垢剂体系诱导组织膨胀
   • 优势：兼容荧光蛋白
   • 局限：耗时数周、透明度中等
4. 水凝胶包埋（如CLARITY）：
   • 丙烯酰胺交联蛋白，电泳脱脂
   • 优势：最佳透明度、结构完整性
   • 局限：需专用设备、神经毒性试剂

新兴技术如UbiClear实现突破：15分钟透明化1mm脑片（图5），无毒试剂兼容常规显微术，保持荧光信号和组织体积。

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三维显微成像技术

荧光显微术基础

宽场成像受离焦光干扰，仅适合薄样本。共聚焦显微术通过针孔过滤离焦光，但光子利用率<1%，且扫描速度慢。

共聚焦激光扫描（CLSM）

点扫描获取光学切片（~1μm厚），Z轴堆叠重建三维结构。针孔缩小可提升轴向分辨率，但伴随光子损失和光毒性，不适于厚样本。

转盘共聚焦

微透镜-针孔转盘并行扫描（图7C），帧率提升百倍。但散射样本中相邻针孔串扰导致图像模糊，穿透深度有限。

光片显微术（LSFM）

正交照明与检测（图7D）：

• 激发光片仅照明焦平面，降低光损伤
• 低倍物镜实现毫米级视野
• 轴向分辨率取决于光片厚度（典型值2-5μm）
  适用透明化样本，但对散射组织敏感。

双光子扫描显微术（2P）

红外飞秒脉冲激发非线性荧光（图7E）：

• 焦点外无激发，无需针孔
• 散射光子可被收集，穿透深度提升
• 红外光（>800nm）处于"光学治疗窗"
  局限：点扫描速度慢，高峰值功率可能损伤样本。

创新方案：OASIS双光子转盘系统

融合双光子激发与并行检测优势（图7F）：

• 单转盘集成微透镜与针孔（5000孔/转）
• 每秒5000转扫描，帧率较传统2P提升80倍
• 水镜（20×/NA1.05）实现150μm视野
• 双通道同步采集（182nm/像素分辨率）
  应用案例：全肠壁神经成像、透明化类器官三维重建、脑片钙信号快速捕获。

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解剖学新纪元

组织透明化与三维成像联用突破四个世纪的光学局限：

• 全器官尺度保留亚细胞结构（如完整小鼠脑神经环路）
• 规避切片伪影，实现真实空间定量（如突触连接统计）
• 推动神经解剖学与肿瘤病理学进入三维时代
  未来需优化标准流程，促进临床转化。技术迭代如三光子显微术（3P）将进一步提升活体成像深度。