IRF3磷酸化通过RIPK1/FADD/caspase-8复合体触发卵巢癌有丝分裂阻滞期GSDME依赖性细胞焦亡的机制研究

本研究针对抗有丝分裂药物诱导的卵巢癌细胞命运不明确问题，揭示了cGAS/TBK1介导的IRF3磷酸化通过招募RIPK1/FADD/caspase-8复合体激活caspase-3/GSDME通路，驱动有丝分裂阻滞期细胞焦亡的新机制。该发现不仅阐明了化疗药物诱导免疫原性死亡的关键分子开关，还为卵巢癌"冷肿瘤"免疫微环境重塑提供了治疗新靶点。

　　

在肿瘤治疗领域，诱导有丝分裂停滞的抗微管药物如紫杉醇(Paclitaxel)和诺考达唑(Nocodazole)是临床常用化疗方案。然而长期以来，细胞经历 prolonged mitotic arrest（延长有丝分裂阻滞）后的最终命运仍存在认知空白。传统观点认为这类药物主要通过凋亡(Apoptosis)或坏死性凋亡(Necroptosis)杀伤肿瘤细胞，但华中科技大学同济医学院附属同济医院的研究团队在《Cell Communication and Signaling》发表的最新研究，揭开了有丝分裂阻滞诱导第三种程序性死亡方式——细胞焦亡(Pyroptosis)的神秘面纱。

研究团队通过构建卵巢癌细胞模型和患者来源异种移植(PDX)模型，结合TCGA数据库分析，系统阐释了cGAS-TBK1-IRF3信号轴在有丝分裂阻滞中的非经典功能。当紫杉醇破坏微管动力学时，细胞进入 prolonged mitotic arrest 状态，此时胞质DNA感受器cGAS激活TBK1激酶，促使干扰素调节因子3(IRF3)在Ser³⁸⁶/Ser³⁹⁶位点发生磷酸化。令人惊讶的是，这种磷酸化IRF3不依赖其转录活性，而是作为"分子脚手架"招募RIPK1/FADD/caspase-8形成死亡复合体（即Ripoptosome），进而级联激活caspase-3并剪切Gasdermin E(GSDME)，最终导致细胞膜穿孔和炎性因子释放的焦亡特征。

关键技术方法包括：1）使用紫杉醇/诺考达唑建立有丝分裂阻滞模型；2）CRISPR/Cas9基因编辑构建cGAS/TBK1/GSDME敲除细胞系；3）免疫共沉淀(Co-IP)验证蛋白互作网络；4）高等级浆液性卵巢癌(HGSOC)患者来源PDX模型；5）流式细胞术检测Annexin V/PI双阳性细胞；6）乳酸脱氢酶(LDH)释放实验量化细胞焦亡程度。

Mitotic arrest induced by anti-mitotic agents led to pyroptosis in ovarian cancer
通过剂量梯度实验发现，紫杉醇(20-40 nM)和诺考达唑(250-1000 nM)处理24小时后，OVCAR8和OVCAR3细胞出现典型焦亡形态——细胞膜 balloon-like bubbles（气球样泡状突起）。Western blot显示GSDME而非GSDMD被特异性剪切，且磷酸化组蛋白H3(p-H3)水平升高证实有丝分裂阻滞发生。CDK1抑制剂RO-3306预处理可逆转该现象，证实焦亡依赖细胞进入有丝分裂期。

Caspase-8/caspase-3/GSDME-mediated pyroptosis
siRNA敲低GSDME使焦亡细胞减少70%（P<0.001），LDH释放下降50%。caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK和泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK均能阻断GSDME剪切。进一步实验显示caspase-8而非caspase-9敲除可完全抑制焦亡，证实该通路为caspase-8/caspase-3/GSDME级联反应。

IRF3 recruited the Ripoptosome complex
Co-IP实验揭示紫杉醇处理12小时后，p-IRF3^Ser386/396与RIPK1/FADD/caspase-8结合增强5倍。构建IRF3磷酸化位点突变体(IRF3-AA)转染细胞后，焦亡标志物表达完全消失，而野生型IRF3可恢复该表型。cGAS或TBK1敲除则显著减弱IRF3与Ripoptosome的互作。

Anti-tumor immunity activation
在免疫健全C57BL/6小鼠模型中，紫杉醇使sg-control组肿瘤体积缩小60%（P<0.001），而sg-GSDME组无显著差异。TCGA分析显示，高表达GSDME/caspase-3的卵巢癌患者肿瘤中CD8⁺T细胞浸润增加3倍，CD163⁺M2型巨噬细胞和CD1C⁺树突细胞比例显著升高。

这项研究首次揭示phospho-IRF3通过非转录依赖方式调控细胞死亡模式的分子开关功能。在生理状态下，低水平p-IRF3诱导BCL-XL依赖性凋亡；而在 prolonged mitotic arrest 条件下，高浓度紫杉醇促使p-IRF3形成Ripoptosome复合体，将死亡模式"切换"为GSDME依赖性焦亡。这种切换具有重要临床意义：1）阐明紫杉醇诱导免疫原性死亡(ICD)的新机制；2）GSDME表达水平可作为预测化疗敏感性的生物标志物；3）为"冷肿瘤"免疫微环境重塑提供联合治疗靶点。研究团队特别指出，该发现为卵巢癌化疗-免疫联合治疗方案的设计提供了理论依据，未来可探索PARP抑制剂与紫杉醇序贯治疗中GSDME的调控价值。