RNA测序在罕见病队列中的临床应用及分子机制新见解

本研究针对RNA测序(RNA-seq)在罕见遗传病诊断中的临床应用瓶颈，通过53例孟德尔疾病疑似患者的队列研究，系统评估了四种特定临床场景下RNA-seq的诊断价值。研究人员发现RNA-seq在解析内含子/外显子剪接变异、典型剪接位点变异、基因内拷贝数变异(CNV)及调控区变异的致病机制中具有69%的诊断效能，揭示了NFU1剪接异构体转换、IDUA转录起始位点变异导致的等位基因偏倚等新型分子机制，为罕见病精准诊断提供了重要技术路径。

　　

在罕见遗传病诊断领域，DNA检测技术如全基因组测序(WGS)已成为临床常规手段，但约50%患者仍无法获得明确诊断。这一诊断缺口部分源于现有技术难以检测RNA水平的转录异常，特别是非编码区变异对剪接调控、转录起始等过程的影响。虽然RNA测序(RNA-seq)技术理论上能弥补这一缺陷，但其临床应用面临两大挑战：一是缺乏明确的应用场景指南，二是对RNA异常与表型关联的机制认识不足。这些瓶颈严重阻碍了RNA-seq在临床实践中的标准化应用和医保覆盖。

多伦多病童医院的研究团队在《Genome Medicine》发表的研究，创新性地设计了基于临床场景的RNA-seq应用框架。研究纳入53例经遗传学家评估的疑似孟德尔疾病患者，根据前期DNA检测结果分为两大群体：33例携带特定类型候选变异（包括非经典剪接位点变异、典型剪接位点变异伴非典型表型、基因内CNV、调控区/非翻译区变异）和20例WGS阴性但高度怀疑遗传病因的病例。研究采用临床可及组织（血液、成纤维细胞、淋巴母细胞系等）进行RNA-seq，结合GTEx数据库建立表达和剪接异常的评价体系，并开发定制化生物信息学流程分析变异特异性转录效应。

关键技术方法包括：1）基于GTEx表达谱的靶组织选择策略（TPM≥5）；2）NEBNext Poly(A) mRNA文库构建与Illumina NovaSeq6000测序；3）STAR双通道比对与RSEM定量分析；4）基于Z-score的剪接异常检测（|Z|≥3）；5）SIRV spike-in质量控制；6）定制参考基因组解析CNV相关融合转录本。样本队列来自医院临床遗传科经伦理批准的研究项目，涵盖多系统（74%）和单系统（26%）表型。

研究结果通过四大临床场景系统呈现：

"RNA-seq澄清非经典剪接位点变异影响并揭示新疾病机制"部分显示，在19例携带21个非经典剪接变异的患者中，RNA-seq成功解析全部变异效应。典型案例包括：SASS6基因c.207-11C>A导致外显子4跳跃（保留PISA结构域部分功能），解释患儿严重小头畸形但存活的表型；NFU1基因c.62+89G>A引发转录本异构体转换，从主要亚型转向通常低表达的N端截短亚型，伴随丙酮酸脱氢酶(PDH)活性降低，阐明非典型线粒体病表型。这些发现不仅确认诊断（47%），还揭示剪接调控异常可导致剂量敏感基因的亚型平衡破坏这一新机制。

"RNA-seq解析典型剪接位点变异与非典型表型关联"部分证实，5例典型剪接位点变异均存在异常转录效应。其中EFTUD2基因+1位点缺失仅导致12%转录本发生1bp移码，与患者不伴智力障碍的轻度表型相符；TBX6基因+2位点变异引发80%转录本跳过首个编码外显子，产生N端截短蛋白，可能解释该家系中伴随多指畸形的独特表型。这些发现强调典型剪接变异也可能产生部分功能转录本，需RNA-seq确认实际分子效应。

"RNA-seq阐明基因内拷贝数变异的分子机制"部分解析了4例CNV的转录效应。COL4A5基因23kb串联重复产生框内转录本，导致胶原蛋白IVα5链延长但稳定表达，阐明家族性薄基底膜病的分子基础；CDKL5基因105kb重复虽为框内排列，但伴随内含子保留导致的NMD，解释男性患者相对温和的癫痫表型。这些结果突破DNA检测局限，首次证实RNA-seq可直观判断CNV的串联排列方式和剪接保真度。

"非翻译区变异通过多机制影响RNA转录"部分发现，IDUA基因5'UTR区c.-87T>C变异（位于转录起始位点+2）导致97%等位偏倚，荧光报告实验证实其显著降低启动子效率，确诊首例由转录抑制引起的Hurler综合征；MAMLD1调控区407kb重复意外激活BEND2基因截短体的异位表达，提示生殖系统畸形可能涉及染色质调节因子的获得性功能异常。这些发现极大拓展了对非编码区变异致病机制的认知。

研究结论指出，RNA-seq在四大临床场景中展现69%的综合诊断效能（45%确诊+24%排除），显著优于WGS阴性病例的检出率（3%）。其核心价值在于：1）建立剪接变异功能注释的金标准；2）揭示剂量敏感基因的亚型平衡调控等新机制；3）为MED14、PPP1R2等新候选基因提供致病证据；4）指导ASO等精准治疗策略设计。该研究不仅为RNA-seq的临床实施提供循证指南，更通过建立表型-基因型-转录型的多维关联框架，推动罕见病诊断从变异检测向机制解析的范式转变。