基于TaqMan实时荧光定量PCR与微滴式数字PCR技术的线粒体内共生菌Candidatus Midichloria mitochondrii检测新方法及野生动物暴露评估

本研究针对蜱传共生菌Candidatus Midichloria mitochondrii（Ca. M. mitochondrii）缺乏高灵敏度检测方法的现状，开发了靶向16S rRNA和gyrB基因的TaqMan实时荧光定量PCR（rt-PCR）与微滴式数字PCR（dd-PCR）技术。首次在赤狐、獾、水獭等6种野生动物中检出该菌DNA，证实dd-PCR具有更高灵敏度（检测限达10-6稀释度），为监测蜱叮咬暴露提供了新型分子标记工具。

　　

在蜱传疾病防控领域，一个鲜为人知的线粒体内共生菌——Candidatus Midichloria mitochondrii（Ca. M. mitochondrii）正引发科学家浓厚兴趣。这种特殊细菌不仅栖息于蜱类线粒体中，更可能通过叮咬传播给脊椎动物宿主。然而现有检测技术存在明显局限：SYBR Green实时PCR只能进行相对定量，而传统PCR方法灵敏度不足，难以捕捉野生动物体内微量的细菌DNA。这一技术瓶颈严重阻碍了利用该菌作为生物标记物监测蜱类叮咬暴露的实践应用。

意大利南部动物预防实验研究所的Alessia Pucciarelli团队在《Veterinary Research Communications》发表的研究中，开创性地建立了两种高精度分子检测体系。研究人员从87只野生动物脾脏样本入手，通过TaqMan探针实时荧光定量PCR（rt-PCR）和微滴式数字PCR（dd-PCR）的双重验证，不仅首次在赤狐（Vulpes vulpes）、欧亚獾（Meles meles）等6个物种中发现Ca. M. mitochondrii感染证据，更揭示dd-PCR技术可检测低至每反应5.7个拷贝的靶DNA，灵敏度显著优于rt-PCR（10^-5稀释度）。这项突破为野生动物蜱传疾病风险预警提供了全新解决方案。

关键技术方法
研究团队采用多阶段技术路线：1）基于16S rRNA和gyrB基因设计特异性引物探针；2）使用10倍系列稀释阳性对照（10^-1-10^-6）验证方法灵敏度；3）采集意大利坎帕尼亚地区13种野生动物脾脏样本（含82只路杀动物和5只圈养个体）；4）通过Qubit 2.0荧光定量和IPC内参排除抑制物干扰；5）采用QuantStudio 1和QX200系统分别进行rt-PCR与dd-PCR平行检测。

研究结果

方法学验证
dd-PCR在两种靶基因检测中均展现卓越性能：对gyrB基因的检测线性范围跨越6个数量级（5.19×10³-1.48×10¹ copies/μL），在10^-6稀释度仍可检出1.3 copies/μL，而rt-PCR在此浓度已呈阴性。两种技术的符合度分析显示gyrB靶点（κ=0.55）优于16S rRNA（κ=0.45）。

野生动物筛查
在16S rRNA检测中，dd-PCR额外检出9例rt-PCR阴性样本（总阳性率14.9% vs 4.6%）。值得注意的是：

• 欧亚水獭（Lutra lutra）阳性率最高（66.6%）
• 普通豪猪（Hystrix cristata）呈现30%感染率
• 圈养羊驼（Vicugna pacos）检出阳性
  gyrB基因检测进一步证实dd-PCR可识别7例rt-PCR漏检样本，包括关键阳性水獭样本（38.5 Ct值对应0.5 copies/μL）。

研究意义
该研究建立了目前最灵敏的Ca. M. mitochondrii绝对定量方法，其创新价值体现在：
1）首次将dd-PCR技术应用于蜱传共生菌检测，克服了传统PCR定量不准、rt-PCR需要标准曲线的缺陷；
2）通过gyrB基因靶向设计实现种水平特异性检测，较16S rRNA更具分类鉴别力；
3）发现该菌可经非主要媒介蜱（如非Ixodes ricinus）传播的新证据，拓宽了对传播途径的认知。

这些发现为野生动物蜱传病原体暴露监测提供了新型生物标记物，尤其在蜱类脱离宿主后仍可通过脾脏检测追溯叮咬历史。研究者特别指出，结合前期人类研究数据（Ca. M. mitochondrii与蜱传病原体感染存在16.1倍相关性），该技术有望成为评估人兽共患病传播风险的预警工具。未来研究可进一步探索不同蜱种携带该菌的生态学特征及其与病原体共感染的调控机制。