新型ddPCR技术同步检测利什曼原虫Leishmania infantum与Leishmania tarentolae及其流行病学意义

本研究针对地中海盆地共存的致病性利什曼原虫Leishmania infantum与非致病性Leishmania tarentolae的检测难题，开发了一种基于微滴数字PCR(ddPCR)的高灵敏度检测方法。该技术通过靶向动基体微环DNA(kDNA)，实现了两种原虫的同步鉴别检测，灵敏度达0.2细胞/μL，为阐明两者在媒介白蛉与犬类宿主中的传播动态及潜在交叉免疫保护机制提供了关键技术支撑。

　　

在地中海盆地的阳光下，一场肉眼看不见的微观战争正在上演——致病性利什曼原虫Leishmania infantum通过白蛉叮咬传播，导致人类内脏利什曼病(VL)和犬类利什曼病(CanL)，而其"表亲"Leishmania tarentolae虽以爬行动物为天然宿主，却意外展现出对哺乳动物的交叉免疫保护潜力。这两种原虫在意大利等地区的共现现象，为流行病学研究带来了双重挑战：传统检测方法难以区分二者，而低载量样本的漏检可能掩盖关键的传播链信息。更引人深思的是，白蛉媒介中发现的线粒体与核基因组检测结果不一致，暗示着自然界可能存在跨亚属原虫杂交的"进化实验"。

为解决这一系列问题，米兰大学的研究团队在《Parasites & Vectors》发表研究，开发了革命性的微滴数字PCR(ddPCR)检测体系。该技术通过创新设计靶向动基体微环保守序列区(CSB1-CSB2)的引物与物种特异性探针，在50°C退火温度下实现56bp产物的高效扩增，其灵敏度达到单个原虫细胞检测水平。研究采用六种实验室培养株（包括L. infantum标准株MHOM/TN/80/IPT-1和L. tarentolae商业株P10）进行梯度稀释验证，并首次将ddPCR应用于野外采集的白蛉DNA检测。

【关键技术方法】
研究采用三阶段验证策略：1) 设计跨物种引物与FAM/HEX标记探针靶向kDNA微环；2) 通过梯度PCR优化退火温度；3) 使用QX200系统检测人工接种犬血样本（10⁶-20细胞梯度）和15只野外白蛉DNA。样本包括13只Sergentomyia minuta和2只Phlebotomus perniciosus，均来自意大利巴里地区的Valenzano市。

【研究结果】

1. 灵敏度突破：
   ddPCR在50°C退火温度下对L. infantum检测效果最佳，而L. tarentolae在55°C表现更优。两种原虫的检测下限均为0.2细胞/μL（相当于反应体系中1个原虫DNA），较传统qPCR提升至少一个数量级。

2. 特异性验证：
   HEX标记的L. infantum探针完全无交叉反应，而FAM标记的L. tarentolae探针在检测L. infantum时出现1-4个假阳性微滴。研究者建议将5个微滴设为阳性阈值。

3. 自然样本检测：
   15只qPCR预筛阳性的白蛉中，ddPCR发现：

• 2例S. minuta同时携带两种原虫（qPCR仅检出L. tarentolae）
• 2例样本（1 S. minuta，1 P. perniciosus）出现核基因组（ITS-1）与线粒体（kDNA）检测结果矛盾，首次提示L.(Leishmania)与L.(Sauroleishmania)亚属间可能存在13.3%的杂交率

1. 原虫载量估算：
   通过标准曲线推算，阳性白蛉携带原虫数从<1至>5000不等，其中三只S. minuta达到检测上限（100万拷贝/μL），对应实际载量超过5000个原虫细胞。

【结论与意义】
该研究建立了首个可同步检测L. infantum与L. tarentolae的ddPCR体系，其创新价值体现在：

1. 技术层面：突破性地将kDNA微环的高拷贝数特性与ddPCR的绝对定量优势结合，解决了低载量样本检测难题；
2. 流行病学层面：为阐明两种原虫在媒介与宿主的共感染动态提供工具，尤其对揭示L. tarentolae的"天然疫苗"潜力至关重要；
3. 理论突破：发现的线粒体-核基因组不一致现象（mitonuclear discordance），为利什曼原虫跨物种遗传交换提供了首个野外证据。

研究者特别强调，在地中海盆地等共现区域，必须联合使用核基因组（如ITS-1）与线粒体标记（kDNA）检测，以避免因杂交现象导致的误判。该技术将推动"One Health"策略下人畜共患病监测体系的革新，并为基于L. tarentolae的疫苗研发提供精准评估工具。