基于乳胶微球免疫层析技术的奶牛早期妊娠相关糖蛋白(PAG)检测方法建立及应用

本研究针对奶牛早期妊娠诊断需求，开发了一种基于乳胶微球和双单克隆抗体的PAG快速检测试纸条。研究人员通过杂交瘤技术获得PAG2特异性抗体2C7和7D5，建立灵敏度达0.2 ng/mL的检测体系。临床测试显示该方法与超声诊断一致性高（κ=0.89），与ELISA试剂盒符合率达98.03%，为中小型牧场提供了一种操作简便、结果可靠的早期妊娠诊断方案。

　　

在奶牛养殖业中，准确判断妊娠状态直接影响着繁殖效率和经济效益。目前常用的直肠触诊和超声诊断存在操作复杂、设备依赖性强等问题，而基于妊娠相关糖蛋白（Pregnancy-associated glycoproteins, PAGs）的ELISA检测又耗时较长。这些技术瓶颈使得中小型牧场难以实现高效、低成本的早期妊娠监测。

为解决这一难题，深圳生物技术有限公司联合中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所的科研团队，在《Applied Microbiology and Biotechnology》发表了创新性研究成果。该研究通过基因克隆技术获得PAG2重组蛋白，利用杂交瘤技术制备出2C7和7D5两株特异性单克隆抗体，成功构建了乳胶微球免疫层析检测系统。

研究采用Western blot验证抗体特异性，通过正交实验优化抗体标记量（2C7为120μg）和包被量（7D5为70μg）。临床样本测试选取559头配种28-32天的荷斯坦奶牛全血样本，与45天超声诊断和商业ELISA试剂盒（IDEXX）进行对比验证。

主要技术方法

1. 基因克隆表达PAG2重组蛋白
2. 杂交瘤技术制备单克隆抗体
3. 乳胶微球标记与试纸条组装
4. 临床样本队列（n=559）验证
5. 超声（n=263）和ELISA对比分析

研究结果

Identification of 2C7 and 7D5 monoclonal antibodies
Western blot证实两株抗体均能识别70 kDa的PAG2蛋白，为后续检测奠定基础。

The sensitivity of latex immunochromatographic test strip
检测限低至0.2 ng/mL，较传统方法灵敏度显著提升。

The specificity of latex immunochromatographic test strip
胆红素、甘油三酯等8种干扰物测试显示无交叉反应，证实方法特异性良好。

Comparison with ultrasound
与超声结果对比显示：灵敏度99.25%、特异性90%、准确率94.68%，κ值达0.89，具有高度一致性。

Comparison with ELISA method
与商业ELISA试剂盒比较显示：阳性符合率98.29%、阴性符合率97.6%，总体符合率98.03%。

讨论与意义
该研究建立的乳胶免疫层析技术突破现有检测方法的时空限制，具有三大创新价值：

1. 时间优势：可在配种后28天实现早期诊断，较超声检查提前约2周
2. 操作便捷：无需专业设备，15分钟即可判读结果
3. 动物福利：避免直肠触诊导致的胚胎损伤风险

值得注意的是，该方法在经产牛和高产牛中可能出现假阴性（PAGs表达量较低），且胚胎早期死亡后7天内可能产生假阳性（PAGs半衰期较长）。这些生物学特性带来的局限也是所有免疫诊断方法面临的共性问题。

这项技术为牧场繁殖管理提供了新的工具选择，特别适合缺乏专业兽医和检测设备的中小型牧场应用。通过缩短空怀期、优化繁殖计划，预计可提升牧场经济效益15-20%。未来研究可进一步优化抗体组合，开发能区分PAGs亚型的检测体系，为奶牛繁殖健康管理提供更精准的技术支撑。