组氨酸中心定位增强交替极性肽的pH响应性DNA组装与基因递送效率

本研究针对非病毒基因载体效率不足的难题，设计了两组组氨酸/苯丙氨酸位置镜像对称的交替极性肽RFH/RHF。通过凝胶阻滞、分子动力学模拟和细胞实验证实，中心定位组氨酸的RFH展现出更显著的pH响应性DNA释放特性，在293T和HeLa细胞中实现高于R9的转染效率（p<0.05），为智能型基因载体设计提供了新思路。

　　

基因治疗领域长期面临非病毒载体效率低下的瓶颈问题。尽管病毒载体如腺相关病毒（AAV）具有天然高效的基因递送能力，但其免疫原性和插入突变风险限制了临床应用。2020年mRNA疫苗中使用的脂质纳米颗粒（LNP）虽取得突破，但仍存在室温稳定性差、非靶向分布等缺陷。在此背景下，模拟病毒精确组装特性的自组装肽（self-assembling peptides）因其可编程的氨基酸序列和良好的生物相容性，成为极具潜力的替代方案。然而，现有研究对氨基酸序列定位如何影响肽-DNA共组装行为的认识仍不充分，特别是组氨酸（histidine）作为pH响应元件的空间排布规律尚未阐明。

为解决这一科学问题，来自伊朗巴斯德研究所的研究团队设计了两组具有镜像对称性的交替极性肽：RFH（RFRHRHRFR）和RHF（RHRFRFRHR），通过系统比较组氨酸位于中心（RFH）与外围（RHF）时的性能差异，揭示了序列定位对基因递送效率的调控机制。这项创新性研究发表在《BMC Biotechnology》期刊，为理性设计智能型基因载体提供了重要理论依据。

研究采用多学科交叉的研究方法：（1）通过凝胶阻滞实验比较不同pH条件下肽-DNA复合物的稳定性；（2）场发射扫描电镜（FESEM）观察纳米结构形态；（3）Martini力场粗粒化分子动力学（coarse-grained MD）模拟分析组氨酸质子化前后的组装行为；（4）293T和HeLa细胞模型评估转染效率和细胞毒性；（5）荧光素酶报告基因（luciferase）定量检测系统评价递送效果。

RFH在酸性pH下表现出减弱的DNA共组装倾向
凝胶电泳结果显示，在中性环境（pH≈7）下，RFH和RHF均在N/P比（amine-to-phosphate ratio）≥10时完全阻滞DNA迁移，与阳性对照R9效果相当。但在酸性条件（pH≈4）下，仅RHF保持DNA结合能力，而中心组氨酸被质子化的RFH则丧失阻滞能力，这与其粗粒化模拟中组氨酸质子化导致DNA接触数锐减（从113.7降至91.7）的结果高度一致。

RFH与RHF形成形态迥异的DNA共组装体
FESEM显微图像揭示了两者显著的结构差异：R9形成典型球形颗粒（<100 nm），RHF产生梭形/X形组装体（600×200 nm），而RFH则形成独特的纤维状结构（长度从数微米降至<1μm随N/P比增加）。这种形态转变暗示组氨酸中心定位可能通过π-π堆叠（π-stacking）改变β片层（β-sheet）的排列方式，进而影响纳米纤维的组装路径。

RFH自组装倾向受组氨酸电离状态深刻影响
分子动力学模拟显示，组氨酸质子化使RFH的溶剂可及表面积（SASA）增幅达15%，显著高于RHF的8%。更关键的是，RFH中苯丙氨酸（phenylalanine）质心周围组氨酸密度降幅达50%，导致其芳香环相互作用网络重构，这解释了其在酸性环境下DNA结合不稳定的分子机制。

RFH在体外转染中展现优势性能
生物评价显示，两种肽的细胞毒性均显著低于聚乙烯亚胺（PEI）（p<0.01）。在N/P比40-60时，RFH的转染效率（以log(RLU/mg protein)计）比R9提高2个数量级，且在HeLa细胞中优于RHF（p<0.05）。这种优势可能源于其pH响应性组装特性：内体酸性环境触发组氨酸质子化，促进DNA释放，而RHF因持续稳定的DNA结合反而降低了基因释放效率。

这项研究首次揭示了组氨酸在肽序列中的空间定位与其pH响应行为的构效关系。中心定位的组氨酸（如RFH）通过增强质子化时的电荷排斥，创造了更灵敏的"分子开关"，而外围定位（如RHF）则表现出更广谱的稳定性。该发现超越了传统的模块化设计（block copolymer）思路，为开发兼具高效转染和精准释放的智能载体提供了新范式。特别值得注意的是，RFH的纤维状组装体模拟了病毒衣壳（viral capsid）的高度有序结构，其长度可调性（N/P比依赖）为定制化载体设计开辟了可能。未来研究可进一步探索这种序列定位原则在更长肽链或靶向模块整合中的应用价值。