MCM9基因缺陷通过损害DNA损伤修复导致人类唯支持细胞综合征的机制研究

本研究针对非梗阻性无精症(NOA)的遗传病因学难题，首次揭示MCM9基因纯合功能缺失突变通过破坏同源重组(HR)和错配修复(MMR)通路，导致唯支持细胞综合征(SCOS)的分子机制。研究人员通过全外显子测序(WES)发现两个新型MCM9突变，结合免疫荧光(IF)、Western blot(WB)和HEK293T细胞模型证实其损害DNA修复功能，为临床预测显微取精术(micro-TESE)失败提供了新型分子标志物。

　　

男性不育领域长期面临非梗阻性无精症(NOA)遗传机制不明的挑战，其中唯支持细胞综合征(SCOS)作为最严重的病理类型，其病因学犹如"黑箱"。虽然已知DNA损伤修复缺陷可能导致生殖细胞丢失，但具体分子通路与人类SCOS的直接证据始终缺失。MCM9作为同时调控同源重组(HR)和错配修复(MMR)的关键因子，在小鼠模型中已被证实与配子发生相关，但其在人类精子发生中的作用仍待阐明。

安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心团队在《Cell Death Discovery》发表的研究，通过30例近亲婚配NOA患者队列的遗传学分析，首次锁定两个新型MCM9纯合突变(c.1151-1G>A和c.1891C>T)。研究采用多组学技术证实这些突变通过双重机制导致SCOS：一方面破坏HR介导的双链断裂(DSB)修复，另一方面干扰MMR系统的纠错功能。该发现不仅填补了DNA修复缺陷与人类SCOS之间的分子桥梁，更为临床预测显微取精术(micro-TESE)结局提供了遗传学标志物。

关键技术方法包括：1) 30例近亲家系NOA患者的全外显子测序(WES)筛选；2) 患者睾丸组织的免疫荧光(IF)和Western blot(WB)验证；3) CRISPR/Cas9构建MCM9敲除HEK293T细胞模型；4) 基于HR报告系统的流式细胞术分析；5) 免疫共沉淀(Co-IP)验证MCM9与MSH2/MLH1互作；6) 单细胞RNA测序(scRNA-seq)解析MCM9表达谱。

【结果】
Identification of novel homozygous LoF mutations in MCM9
通过WES和Sanger测序在2例SCOS患者中发现MCM9纯合突变，WB证实突变睾丸组织完全缺失MCM9蛋白表达，免疫荧光显示突变体生精小管仅存SOX9阳性支持细胞。

c.1151-1 G>A mutation causes skipping of exon 7
迷你基因实验证实该剪接突变导致外显子7跳跃，产生不稳定截短转录本，通过无义介导的mRNA衰变(NMD)机制降解。

MCM9 deficiency causes complete depletion of germ cells
组织学分析显示突变睾丸生精小管基底膜增厚、管腔狭窄，免疫标记证实LIN28A(精原细胞)、γH2AX(精母细胞)和DDX4(生殖细胞)信号完全缺失，符合SCOS病理特征。

Human testicular MCM9 is predominately expressed in spermatogonia
单细胞转录组和免疫共定位显示MCM9主要在精原干细胞(SSC)和精母细胞表达，提示其功能集中于生殖细胞早期发育阶段。

MCM9 deficiency impairs DNA damage repair capacity
依托泊苷(ETO)诱导实验显示突变细胞γH2AX信号持续升高，顺铂敏感性实验证实MCM9敲除细胞存活率显著降低，RPA2招募缺陷提示HR修复功能障碍。

Deficient HR and MMR may underlie DNA repair impairment
HR报告系统显示MCM9缺失使EGFP修复效率降低60%，Co-IP证实睾丸组织中MCM9与MSH2/MLH1形成复合物，揭示其通过双重途径维持基因组稳定性。

MCM9 deficiency causes sperm retrieval failure
两位患者显微取精术均未获精子，与小鼠模型中5%残存生精小管不同，人类MCM9缺陷表现为完全SCOS，提示更强的基因型-表型关联。

【结论与意义】
该研究首次建立MCM9缺陷-修复功能障碍-生殖细胞耗竭的完整病因链，揭示HR和MMR通路协同维护人类精子发生的新机制。临床层面证实MCM9双等位基因突变可作为micro-TESE失败的预测指标，为遗传咨询提供分子依据。理论层面突破小鼠模型局限性，发现人类生殖细胞对DNA修复缺陷更具敏感性。技术层面创新性整合CRISPR编辑、HR报告系统和单细胞测序，为男性不育研究提供多组学分析范式。研究将基础发现与临床预后相结合，推动NOA从经验性治疗向精准医学跨越。