基于Sortase介导的枯草芽孢杆菌表面展示技术开发鸡坏死性肠炎嵌合蛋白疫苗

为解决鸡坏死性肠炎（Necrotic Enteritis, NE）疫苗开发难题，伊朗国家遗传工程与生物技术研究所团队通过Sortase介导的表面展示技术，在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）表面表达包含产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）三种毒素（CPA、NetB、ZMP）的嵌合蛋白（R-anz）。研究证实该疫苗可激活鸡Toll样受体21（TLR21）通路，显著提升IgY抗体水平及IFN-γ、IL-4等细胞因子表达，降低肠道病变评分（p<0.01），为无抗养殖提供新策略。

　　

鸡坏死性肠炎防控的新曙光：嵌合蛋白疫苗的突破性进展

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）引发的坏死性肠炎（NE）是全球家禽业的“隐形杀手”，每年造成超60亿美元经济损失。传统抗生素防控面临耐药性挑战，而现有单抗原疫苗保护力有限。这一困境背后，是产气荚膜梭菌复杂的毒素武器库——α毒素（CPA）破坏细胞膜磷脂，NetB毒素形成穿孔通道，锌金属肽酶（ZMP）降解宿主上皮屏障。如何同时靶向多重毒力因子，成为疫苗设计的核心难题。

伊朗国家遗传工程与生物技术研究所与德黑兰Modares大学的研究团队另辟蹊径，将蛋白质工程与黏膜免疫策略相结合。他们利用枯草芽孢杆菌这一“微生物工厂”，通过Sortase酶介导的表面展示技术，将CPA、NetB和ZMP的免疫原性片段整合为78 kDa嵌合蛋白（R-anz），首次实现三价抗原的细菌表面共展示。这项发表于《Microbial Cell Factories》的研究，为NE防控提供了全新解决方案。

关键技术方法
研究采用生物信息学预测R-anz与鸡TLR21的相互作用，通过DNA重组技术构建pHT2410载体表达嵌合蛋白。利用枯草芽孢杆菌BsHT2410株实现表面锚定，通过口服免疫评估疫苗效果。采用ELISA检测IgY抗体，qPCR分析IFN-γ等细胞因子，病理评分（0-5分制）量化肠道损伤。

研究结果

1. 生物信息学验证疫苗设计合理性
通过I-TASSER建模的R-anz三维结构显示，其β-折叠占比达74.4%（Ramachandran图验证）。HADDOCK分子对接预测R-anz与TLR21通过9个氢键结合，关键相互作用涉及Ser⁴⁹⁵-Thr³²⁷等残基对，结合能-70.0±2.2（表5），为免疫激活提供理论依据。

2. 表面展示系统成功构建
SDS-PAGE与Western blot在78 kDa处检出目标条带（图3A-B），ELISA证实嵌合蛋白定位于细菌表面（图3C）。值得注意的是，α-螺旋 linker（A(EAAAK)₄A）的设计有效维持了抗原空间构象。

3. 双重免疫应答激活
口服免疫后，重组菌组（RBS）血清IgY水平较野生型组（WBS）提升3倍（p<0.01，图4）。qPCR显示IFN-γ、IL-4、IL-22表达上调3.5倍，而促炎因子IL-17下调65%（图7），提示Th1/Th2/Th22通路协同作用。

4. 显著临床保护效果
攻毒实验显示，疫苗组肠道病变评分仅0.43（对照组1.29，p<0.01），且无4-5分严重坏死（图5）。体重增长提高23.8%（图6），证实疫苗缓解了NE导致的生长抑制。

结论与意义
该研究开创性实现三点突破：（1）首次将Sortase展示技术应用于禽用疫苗，避免传统纯化工艺的复杂性；（2）多抗原协同激活TLR21通路，诱导黏膜与系统免疫双重应答；（3）口服递送方式契合规模化养殖需求。尽管目前保护率为部分性（67%病变减少），但为开发无抗饲料添加剂奠定基础。未来需优化抗原比例、评估交叉保护力，并探索与益生菌的协同效应。这项技术平台还可扩展至其他畜禽病原体疫苗开发，标志着蛋白工程在兽用生物制品领域的重大进步。

（注：全文数据及图表均引自Al-Aneed等2025年原文，未添加非文献依据的推测）