细菌鞭毛外膜完整结构解析揭示鞭毛蛋白组装新机制

研究人员通过冷冻电镜技术解析了沙门氏菌和空肠弯曲菌鞭毛外膜完整结构，首次获得FliD帽复合物(3.7 ?)和FlgKL钩-丝连接区(2.9 ?)的高分辨率结构。研究发现FliD帽蛋白通过顺时针旋转促进鞭毛蛋白(FliC)的折叠与整合，而钩-丝连接区(FlgKL)作为机械缓冲器隔离钩部应力。该研究阐明了鞭毛丝状体组装的分子机制，为病原菌运动性和感染机制研究提供新见解。

　　

细菌鞭毛是自然界最精妙的纳米机器之一，这种由数百种蛋白质组成的复杂结构不仅是细菌运动的"螺旋桨"，更是沙门氏菌(Salmonella enterica)和空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)等病原体实现黏附和定植的关键武器。尽管科学家已对鞭毛基本结构有所了解，但关于其最外端的两个核心部件——负责鞭毛蛋白(FliC)组装的FliD帽复合物，以及连接钩部与丝状体的FlgKL连接区——仍存在诸多未解之谜。这些结构如何协同工作？鞭毛蛋白如何被精准地"缝制"到不断延长的鞭毛末端？这些问题的答案对于理解细菌运动机制和开发新型抗菌策略至关重要。

来自德国马克斯·普朗克感染生物学研究所和英国伦敦大学的研究团队在《Nature Microbiology》发表重要成果，通过冷冻电镜技术首次解析了完整细菌鞭毛外膜的超高分辨率结构。研究采用冷冻电子断层扫描(cryo-ET)观察天然状态下的鞭毛尖端，结合单颗粒冷冻电镜技术获得FliD帽复合物(3.7 ?)和FlgKL连接区(2.9 ?)的原子模型，并利用结构引导的基因突变和功能实验验证了关键发现。

【主要技术方法】
研究构建了短鞭毛突变株实现样品制备，采用冷冻电镜断层扫描(cryo-ET)获得68张含252个鞭毛尖端的断层图像。通过单颗粒冷冻电镜解析沙门氏菌鞭毛结构，利用三维变异性分析(3DVA)捕捉FliD构象变化。对空肠弯曲菌ΔflhGΔflaAB微型细胞进行冷冻电镜分析，获得6.5 ?的帽-连接区复合物结构。结合定点突变、荧光显微镜、运动性分析和蛋白分泌检测等实验验证结构发现。

【研究结果】

1. 完整细胞外鞭毛结构
   通过冷冻电镜解析的复合结构显示，FliD形成五聚体"橡果状"结构，其D2-D3结构域平面呈不对称倾斜(56°-84°)，中心腔体最窄处仅14 ?。钩-丝连接区(FlgKL)由11个FlgK和11个FlgL亚基分层组装，总长度达250 ?，形成连续的分泌通道(图1d-f)。

2. 天然帽结构与丝状体相互作用
   FliD通过D0-D1结构域与相邻FliC形成差异化的结合界面，其中FliD4亚基独特的相互作用模式提示其参与新FliC整合(图2b-c)。三维变异性分析捕捉到FliD亚基的构象变化：在FliC整合过程中，FliD4的D0-D1结构域上移25 ?并顺时针旋转18°，其N端环旋转90°以稳定FliC(图3a-d)。

3. FliD末端区域介导鞭毛蛋白插入
   结构引导的突变分析显示，FliD D0结构域疏水残基突变(V9R/F440R)导致鞭毛长度缩短38%-52%，运动能力下降50%。泄漏实验证实突变体分泌的游离FliC增加至35%(野生型仅17%)，表明FliD末端对FliC整合的关键作用(图4c-i)。

4. 天然钩-丝连接区结构
   FlgK和FlgL分别形成11聚体层，FlgK的D1结构域螺旋不连续性赋予其弹性。三维变异性分析显示，从伸展到压缩状态转变时，FlgK D0/D2结构域向管腔弯曲，而FliC几乎不变，证实连接区作为机械缓冲器的功能(图5a-b)。

5. 钩-丝连接区突变损害运动性
   FlgK D519R和FlgL I44S/L260S双突变使运动能力分别降至57%和73%。剪切实验显示突变体鞭毛更易断裂(40次剪切后残留鞭毛数从3条降至2条)，证实FlgKL界面稳定性对鞭毛功能的重要性(图5d-e)。

6. 结合HFJ的帽复合物结构
   空肠弯曲菌微型细胞分析显示，未负载FliC的FliD帽呈现更平坦的D2-D3平面(89°-95°)。FliD3与FliD4间的间隙被确认为首个FliC整合位点，揭示了丝状体组装的起始机制(图6h-i)。

【结论与意义】
该研究首次在原子水平揭示了细菌鞭毛外膜的完整结构，阐明了FliD帽通过构象变化和顺时针旋转驱动鞭毛蛋白组装的动态过程。研究发现FlgKL连接区作为"分子减震器"的关键作用，解决了鞭毛钩部柔性与丝状体刚性之间的力学矛盾。这些发现不仅完善了细菌运动器官的组装理论，更为针对鞭毛结构的抗菌策略开发提供了精确的分子靶点。特别值得注意的是，研究揭示的"旋转-折叠"组装机制可能普遍存在于其他细菌分泌系统中，为纳米机器自组装研究提供了新范式。

这项工作由Rosa Einenkel和Kailin Qin共同主导，Marc Erhardt和Julien R.C. Bergeron共同领导，展示了冷冻电镜技术在超大型复合体研究中的强大能力，为后续研究病原菌感染机制和运动抑制剂的开发奠定了结构基础。