用区间假设替代标准化方法显著提升差异表达与差异丰度分析的准确性

研究人员针对差异表达(DE)和差异丰度(DA)分析中标准化方法引入偏差的问题，提出了一种基于区间假设的创新框架。该研究通过将严格标准化假设扩展为可自定义的区间范围，开发了复合T检验(GTT)和广义T检验(CTT)方法。实验证明，该方法能将假阳性率从45%降至5%，同时保持统计功效，为微生物组和转录组研究提供了更可靠的推断工具。

　　

在微生物组和基因表达研究中，差异分析常因数据组成的特性面临根本性挑战。当前主流的标准化方法（如DESeq2、edgeR等）隐含了关于生物系统尺度的强假设，例如假定总微生物负荷或细胞转录总量不变。这些未经验证的假设会引入偏差，导致假阳性率高达70%，且随着样本量增加，错误结论的置信度反而会异常升高——这种现象被称为"未被承认的偏差(unacknowledged bias)"。

为解决这一难题，宾夕法尼亚州立大学的Kyle C. McGovern和Justin D. Silverman团队在《BMC Bioinformatics》发表研究，提出用"区间假设"替代传统标准化方法。该方法允许研究者通过定义θ^⊥（尺度对数倍比变化）的合理范围来表达生物学上更可信的假设，并开发了相应的统计检验框架。研究通过整合区间假设与流行的ALDEx2分析流程，创建了ALDEx2-CTT和ALDEx2-CTT两种新方法。

关键技术包括：1）基于Multinomial-Dirichlet bootstrap的组成不确定性估计；2）区间假设转化为区间零假设的统计框架；3）复合T检验(CTT)和广义T检验(GTT)的开发；4）利用口腔微生物组数据集（含32个样本的16S rRNA-seq和流式细胞数据）和TCGA肾癌RNA-seq数据集（80个样本）进行验证。

【主要结果】
背景与方法创新
研究团队系统阐述了序列计数数据的根本局限：观测数据仅能反映微生物或基因的相对组成(W^∥)，而无法直接获取系统尺度信息(W^⊥)。通过数学推导证明，真实的差异分析必须同时考虑组成变化(θ_d^∥)和尺度变化(θ^⊥)。提出的区间假设框架θ^⊥∈[θ_l^⊥,θ_u^⊥]可兼容四种常见场景：抗生素研究的单向区间、流式细胞数据的置信区间、CLR标准化的误差区间以及看家基因的稳定表达区间。

模拟研究验证
使用SparseDOSSA2模拟微生物数据集（D=100个微生物，N=10-300样本）显示：当真实θ^⊥=1.73时，采用正确区间假设[0,1.75]的ALDEx2-GTT将假阳性率控制在5%以下，而标准化方法的假阳性率普遍超过20%。即使采用错误区间[0,0.5]，新方法的假阳性率仍显著低于DESeq2等工具。特别值得注意的是，在样本量增至300时，LinDA虽然检出率达76%，但其三分之一"显著差异"实为假阳性；相比之下，ALDEx2-GTT的假阳性率仅为1/3000。

真实数据应用
在牙齿 brushing口腔微生物研究中，基于流式细胞数据确定的黄金标准区间[-1.89,-0.43]准确识别了链球菌(Streptococcus)和嗜血杆菌(Haemophilus)的真实减少。而标准化方法错误地将普雷沃菌(Prevotella)判定为减少，将新月形单胞菌(Selenomonas)误判为增加。更惊人的是，仅通过文献检索设定区间[-6.6,-0.4]（对应刷牙后微生物负荷减少25-99%），新方法就实现了与黄金标准完全一致的结果。

看家基因案例
分析TCGA肾透明细胞癌(CCRCC)数据时，以GAPDH为看家基因的传统标准化导致PPIA、TBP等已知稳定基因被误判为差异表达。而采用区间假设θ^⊥∈[-θ_GAPDH^∥, -θ_GAPDH^∥+2.5]的新方法，则准确识别了NNMT、VEGFA等真正的差异表达基因，同时避免了上述假阳性。

【结论与意义】
该研究建立了区间假设的理论框架和实用工具，解决了标准化方法导致的推断偏差问题。与先前提出的尺度模型相比，区间假设具有三大优势：1）无需指定概率分布，只需定义生物学合理范围；2）保留经典频率学派统计量（如p值）；3）对错误设定的鲁棒性更强。研究证实，即使基于粗略文献估计的宽泛区间（如刷牙研究），也能显著改善分析质量。

这项工作为微生物组和转录组研究提供了更严谨的分析范式，其开源工具INDExA（Interval Null Differential Expression/Analysis）已实现算法落地。未来可进一步拓展至PCR偏差校正等其他测量误差场景，推动组学数据解读从"相对差异"迈向"绝对变化"的精准时代。