多物种生物膜中基因型与表型多样性的进化机制及其在农业与生物农药中的应用

本研究针对微生物群落中种间相互作用与空间结构如何影响苏云金芽孢杆菌(BT)的进化动态这一关键问题，通过短期进化实验揭示了spo0A基因突变导致的非产孢变异体在生物膜环境中的适应性优势。研究发现BT"浅色变异体"通过缩短世代时间、减少基质蛋白TasA产生等机制，在与假单胞菌(PD/PB)共培养时表现出显著竞争优势，为微生物群落应用提供了新见解。

　　

在自然界复杂的微生物群落中，细菌如何适应环境挑战始终是微生物生态学的核心问题。传统观点认为，细菌主要通过表达特定性状、获得新突变或利用群体内已有的遗传变异来实现适应。然而，在真实的生物膜环境中，微生物不仅面临空间结构的限制，还需要应对种间复杂的相互作用——这些因素如何共同塑造细菌的进化轨迹，特别是对于革兰氏阳性菌的研究仍存在显著空白。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, BT)作为一种重要的革兰氏阳性菌，以其杀虫特性闻名，常被用作生物农药。与此同时，假单胞菌属(Pseudomonas)细菌因其促进植物生长的特性，在农业领域具有重要价值。当这些微生物在自然环境中形成多物种生物膜时，它们之间会产生独特的协同效应，这种复杂互作如何影响BT的进化适应尚不清楚。更值得注意的是，生物膜中的空间隔离可能改变选择压力，使得在非结构化环境中处于劣势的变异体获得生存优势。

来自丹麦哥本哈根大学等机构的研究团队在《npj Biofilms and Microbiomes》发表的研究，通过创新的实验设计揭示了多物种生物膜环境中BT的进化动态。研究人员将BT与从丹麦Kalundborg污水处理厂共分离的Pseudomonas defluvii(PD)和Pseudomonas brenneri(PB)共同培养，在生物膜和浮游条件下进行了为期8天的短期进化实验。研究采用全基因组测序、荧光凝集素染色、基质蛋白质组学和竞争性生长实验等关键技术，系统分析了变异体的基因型-表型关联及其生态适应性。

研究结果部分：

"BT表型变异体的出现"部分显示，在所有重复进化实验中均检测到一种特殊的BT表型变异体（称为"浅色变异体"），其在生物膜条件下比野生型表现出更高的适合度（CFU计数增加18.2倍），且在与PB和/或PD共存时选择压力更强。这种变异体通过Congo Red染色可直观区分，表明其基质成分发生了改变。

"BT'浅色变异体'表现出与祖先不同的表型特征"部分揭示，变异体丧失了37%的沉降能力，形成单细胞悬浮液而非聚集簇，且完全丧失了产孢能力。生长曲线分析显示变异体具有更短的世代时间（t_gen）和更高的生长速率（r），这可能是其在竞争中占据优势的关键因素。

"BT浅色变异体在产孢相关基因中显示突变"部分通过全基因组测序发现，所有变异体均在spo0A（控制产孢和生物膜基质产生的关键调控因子）或soj（参与染色体分配和产孢调控）基因中存在突变。特别是V1、V3和V6变异体分别携带导致spo0A功能丧失的不同突变类型，包括大片段缺失和非同义突变。

"混合生物膜中变异体的基质产生减少"部分通过结晶紫染色和CFU计数证明，虽然变异体在单培养时生物膜形成能力与祖先相当，但在与PB共培养时，祖先菌株的基质诱导显著更强（p=0.0021）。竞争实验显示变异体在生物膜环境中比野生型丰富4.8-48倍，且这种优势在假单胞菌存在时进一步增强。

"共培养和BT基因型改变基质聚糖组成"部分采用78种荧光凝集素筛选发现，AAL（识别α-岩藻糖）在变异体中的结合信号减弱，表明细胞壁糖缀合物组成改变。图像定量显示变异体的单位生物量凝集素结合量无显著差异，但共培养条件消除了基因型间的差异。

"BT浅色变异体的基质蛋白丰度响应共培养而降低"部分通过基质蛋白质组学揭示，祖先菌株单培养时检测到150种特有蛋白（包括TasA基质蛋白和SpoVG孢子形成蛋白），而变异体中这些蛋白显著减少。共培养使BT基质蛋白减少90%，但祖先菌株仍保留15种特有蛋白，包括与PB互作相关的四种关键蛋白。

研究结论与讨论部分指出，这项工作挑战了"生物膜进化必然选择更强生物膜形成表型"的传统观点，揭示了资源竞争优化可能比基质强化更受选择青睐。spo0A突变导致的非产孢变异体通过缩短世代时间、减少能量消耗的基质产生等策略，在多物种生物膜中获得竞争优势。特别值得注意的是，这种适应性进化具有环境依赖性——生物膜空间结构和假单胞菌的共存显著增强了变异体的选择优势。研究发现的BT-Pseudomonas互作模式为设计农业微生物菌剂提供了新思路，通过调控spo0A通路可能优化菌群组成和功能。该研究首次系统揭示了革兰氏阳性菌在多物种生物膜中的进化规律，为理解自然微生物群落的组装机制提供了重要范例。