核RNA荧光放大技术nuclampFISH实现基于转录爆发的细胞分选与染色质分析

本研究针对传统FISH扩增技术（如clampFISH和HCR）难以检测核内转录位点、无法实现基于转录爆发的细胞分选等问题，开发了nuclampFISH技术。该技术通过可逆交联剂DSP处理、核分离优化和指数级信号放大，首次实现了基于核RNA表达的细胞分选，并证明转录活跃细胞的染色质可及性更高。这一突破为研究转录调控机制与染色质动态提供了新工具，成果发表于《BMC Genomics》。

　　

基因表达的时空异质性是生命科学的核心问题之一。在单细胞水平，RNA聚合酶II（Pol II）以"转录爆发"（transcriptional bursting）的方式间歇性激活基因，导致相邻细胞间出现显著的表达差异。虽然RNA荧光原位杂交（FISH）技术能检测转录位点，但传统扩增方法如clampFISH（click-amplifying FISH）和杂交链式反应（HCR）因大分子探针难以穿透核膜、交联蛋白阻碍等问题，无法有效放大核内RNA信号。更关键的是，甲醛固定会破坏染色质结构，阻碍下游生化分析。这些技术瓶颈使得科学家长期无法回答一个基础问题：转录活跃细胞的染色质状态究竟有何特殊性？

为解决这一难题，来自中国的研究团队开发了nuclampFISH（nuclear clampFISH）技术平台。该技术通过三个关键创新实现了突破：首先采用可逆交联剂二硫代双（琥珀酰亚胺丙酸酯）（DSP）替代甲醛，既保持RNA完整性又兼容下游分析；其次通过核分离技术去除细胞膜和胞质障碍；最后优化盐浓度和表面活性剂条件，使探针能高效结合核内靶标。研究人员以EEF2基因为模型，证明经Pladienolide B（Pla B）剪接抑制处理后，nuclampFISH可指数级放大核内RNA信号（每轮扩增1.74倍），其灵敏度显著优于传统clampFISH（p<0.0001）。通过流式分选不同转录活性的细胞群体，首次揭示高转录活性细胞（G3组）的染色质可及性比低活性群体（G1组）提升3.16倍（p<0.0001），而看家基因UBC无此变化。这项发表于《BMC Genomics》的研究，为解析转录调控与表观遗传的因果关系提供了方法论基础。

关键技术包括：1）核分离与DSP可逆交联处理；2）多轮clampFISH探针指数扩增（2-8轮）；3）流式细胞分选基于核RNA信号；4）染色质可及性分析（Epiquik试剂盒）。使用HeLa细胞系并通过剪接抑制剂Pla B增强转录信号。

核分离与参数优化实现核RNA指数扩增
通过比较smFISH、clampFISH和HCR对EEF2基因的检测效率，发现传统方法在转录位点的信号丢失率高达60%（p=0.0001）。核分离后，5X SSC缓冲液与0.25% Triton X-100的优化组合使nuclampFISH信号提升3倍，且NEAT1 lncRNA等核内RNA均获有效检测。

可逆交联兼容下游分析
DSP交联的RNA检出效率（MFI=615.16）与甲醛固定（740.27）相当，经DTT处理后能完全解除交联，使染色质可及性分析信号恢复3.16倍。

转录活性导向的细胞分选
四轮扩增的nuclampFISH使流式检测信号出现数量级差异，分选的G1-G3群体其RT-qPCR结果与显微信号强度高度相关（r=0.93）。

染色质可及性与转录爆发正相关
在EEF2基因座，高转录组（G3）的染色质开放程度显著高于低转录组（p<0.0001），而UBC基因无此差异，证实该效应具有基因特异性。

这项研究建立了首个能将转录爆发检测、细胞分选与染色质分析串联的技术平台。其核心价值在于：1）突破核内RNA检测的物理屏障；2）保留染色质天然状态的可逆交联策略；3）首次实现转录活性与表观特征的因果关联分析。尽管在分辨单个爆发位点方面仍有局限，但该技术为研究癌症异质性、发育重编程等过程中转录动力学的表观遗传调控开辟了新途径。未来结合Pol II ChIP-qPCR等技术，有望进一步揭示转录爆发的分子开关机制。