连接蛋白43作为非经典表型稳定因子促进胶质母细胞瘤细胞上皮/间质混合表型的研究

本研究针对胶质母细胞瘤(GBM)治疗抵抗性难题，揭示了连接蛋白43(Cx43)通过激活NF-κB通路驱动上皮/间质转化(EMT)混合表型的新机制。研究人员发现高表达Cx43的CT2A细胞通过增强间隙连接通讯(GJIC)促进集体迁移和干性特征，而低表达Cx43的KR158细胞则依赖隧道纳米管(TNT)进行细胞间通讯。该研究为GBM靶向治疗提供了新思路。

　　

胶质母细胞瘤(GBM)作为最具侵袭性的脑肿瘤，患者中位生存期仅15-18个月，其治疗困境主要源于癌症干细胞(CSC)的 therapy resistance。近年研究发现，上皮-间质转化(EMT)过程中出现的 hybrid epithelial/mesenchymal (E/M) phenotype 与肿瘤转移和 stemness 获得密切相关，但调控这一混合表型的分子机制尚不明确。尤其值得注意的是，gap junction protein connexin43 (Cx43)在GBM中表现出双重角色——既能抑制肿瘤又可促进进展，这种矛盾功能背后的机理亟待阐明。

针对这一科学问题，研究人员开展了一项创新性研究，论文发表在《Translational Oncology》。研究团队通过比较两种 high-grade 小鼠 astrocytoma 细胞系(CT2A与KR158)，结合 DBT 和 DBT-Erp29 细胞模型，运用 Western blot、免疫荧光、Lucifer yellow dye transfer、隧道纳米管成像等关键技术，系统探究了Cx43在EMT调控中的作用机制。

研究结果显示：

1. 胶质母细胞瘤细胞中Cx43和间隙连接组装的差异表达
   CT2A细胞表现出更强的Cx43膜定位和功能性间隙连接，Triton X溶解实验证实其表面Cx43富集程度显著高于KR158细胞。

2. 胶质母细胞瘤细胞中功能性间隙连接和半通道活性的差异形成
   通过Lucifer yellow染料转移实验发现CT2A细胞的gap junction intercellular communication (GJIC)活性更强，而Ethidium bromide (EtBr)摄取实验显示其hemichannel activity也更为活跃。

3. Cx43赋予应激抗性并增强克隆集落形成
   血清饥饿实验证明CT2A细胞具有更强的stress resistance，克隆形成实验显示其colony-forming ability是KR158细胞的2.3倍。

4. Cx43促进集体细胞迁移——混合E/M表型的标志特征
   划痕实验观察到CT2A细胞呈现典型的collective cell migration模式，免疫印迹显示其同时高表达上皮标志物occludin和间质标志物vimentin，证实其处于hybrid E/M状态。

5. CX43通过调节关键EMT/MET调控因子促进胶质母细胞瘤中表型稳定的E/M状态
   TCGA数据库分析发现GJA1(Cx43基因)与EMT抑制因子GRHL3呈正相关(r=0.25)，与EMT促进因子SNAI1负相关(r=-0.23)。

6. 传统通路——经典WNT/β-catenin信号通路在GBM中未激活以促进部分EMT
   与肺癌细胞A549不同，GBM细胞中未检测到β-catenin表达，表明canonical Wnt pathway不参与其EMT调控。

7. NF-κb通路激活促进混合E/M表型，与GBM中CSC标志物表达增加相关
   CT2A细胞中NF-κB通路关键蛋白P-65和IKK2表达量显著升高，伴随stemness marker CD44上调。

8. ERp29介导的Cx43向细胞表面运输调节NF-κb通路的激活
   ERp29过表达的DBT-Erp29细胞显示更强的NF-κB活化，证实Cx43膜定位与通路激活的直接关联。

9. GJIC缺失诱导隧道纳米管形成以促进胶质母细胞瘤细胞的替代性细胞间通讯
   STED显微镜观察到KR158细胞形成长度达CT2A细胞3.2倍的tunneling nanotubes (TNTs)，补偿其GJIC缺陷。

这项研究首次揭示Cx43作为non-canonical phenotypic stability factor的新功能，通过ERp29依赖性膜定位激活NF-κB通路，促使GBM细胞维持在具有最强tumorigenic potential的hybrid E/M状态。该发现不仅解释了Cx43在GBM中的"双刃剑"作用，更为重要的是，指出靶向Cx43膜运输或NF-κB通路可能成为克服GBM治疗抵抗的新策略。研究还创新性地发现GJIC与TNTs在细胞通讯中的互补关系，为理解肿瘤微环境交互提供了新视角。这些突破性发现对开发针对CSC的精准疗法具有重要指导价值。