基于探针捕获富集技术的呼吸道合胞病毒与人诺如病毒全基因组精准解析及其转录组特征研究

本研究针对呼吸道合胞病毒(RSV)和人诺如病毒(HuNoV)基因组测序的挑战，开发了覆盖1,570株RSV和1,376株HuNoV的探针捕获富集技术。通过85例RSV鼻拭子和55例HuNoV粪便/肠类器官样本验证，成功实现RSV全基因组100%覆盖和HuNoV 85%覆盖率，病毒 reads富集效率提升850倍(RSV)和40倍(HuNoV)，首次揭示RSV亚型特异性ORF表达模式，为疫苗研发和流行病学监测提供新工具。

　　

在全球范围内，呼吸道合胞病毒(RSV)和人诺如病毒(HuNoV)如同两个隐形的健康威胁者——前者每年导致3300万例下呼吸道感染，是婴幼儿死亡的主要病原；后者则以6.77亿例急性胃肠炎病例成为全球腹泻病的头号元凶。尽管这两种RNA病毒分属不同家族（RSV为肺炎病毒科 Orthopneumovirus hominis 物种，HuNoV为杯状病毒科 Norovirus norwalkense 物种），它们却共享着让科学家头疼的特性：高度变异的基因组、低病毒载量的临床样本，以及复杂的亚型多样性。传统测序方法在应对RSV的24个A亚型谱系、16个B亚型谱系，或HuNoV的10个基因群（GI-GX）时往往力不从心，尤其当样本Ct值超过30时，基因组覆盖率常断崖式下跌。

为破解这一难题，Baylor College of Medicine等机构的研究团队在《Scientific Reports》发表了一项突破性研究。他们设计了两套"病毒基因组捕手"——针对RSV的87,025条80bp探针（覆盖99.79%已知株）和针对HuNoV的39,300条探针（覆盖99.68%株），通过创新的捕获富集策略，在Ct值高达34.8的样本中仍能拼出完整病毒基因组拼图。这项技术不仅实现了RSV全样本(85/85)和HuNoV绝大多数样本(47/55)的全基因组覆盖，更首次利用捕获数据绘制了RSV亚型特异性转录组图谱。

研究团队采用三大关键技术：1）基于Ct值分级的样本分层建库策略，采用NEBNext?双链cDNA合成模块处理鼻拭子/粪便RNA；2）生物素标记探针杂交富集体系，针对RSV 15.2kb和HuNoV 7.5-7.7kb基因组设计重叠探针；3）VirMAP分析流程结合CDC HuNoV分型工具，实现从原始数据到基因分型的一站式解析。样本队列包含CDC新疫苗监测网络(NVSN)的儿科RSV阳性鼻拭子，以及GI.1型HuNoV人体挑战试验的粪便样本。

测序结果与捕获效率

数据显示捕获后RSV reads占比从0.08%飙升至85.1%，HuNoV从1.15%提升至40.8%。在Ct<30样本中，97% HuNoV获得>20x覆盖度的完整基因组，即使Ct>30样本仍有65%成功率。

基因组完整性

所有85例RSV样本均获得15,116-15,346bp完整基因组，覆盖深度达3,153x-305万x。而HuNoV样本中GII.4型检出率最高，与全球流行趋势一致。

RSV ORF表达谱

首次发现RSV-A中SH(124,303 FPKM)和G(109,011 FPKM)基因表达最高，而RSV-B中G(98,558 FPKM)和M(49,966 FPKM)占优势，揭示亚型间差异调控机制。

这项研究建立的标准化流程具有三重里程碑意义：首先，探针库覆盖99%以上已知变异株，解决了传统方法对GII.4型HuNoV或RSV Ontario(ON)株等新变种捕获效率低的问题；其次，在造血干细胞移植患者长期排毒监测中，该技术已成功用于追踪RSV糖蛋白G的适应性突变；更重要的是，通过解析ORF表达梯度，为理解RSV亚型间致病性差异提供了分子基础。随着RSV疫苗的推广，这套高灵敏度基因组监测工具将成为评估疫苗选择压力的"黄金标准"，而其揭示的转录调控规律，或为新一代抗病毒药物开发指明方向。