综述：利用基因编码分子工具探究GPCR信号传导的时空组织

这篇综述系统阐述了如何利用荧光蛋白(FP)基生物传感器和分子工具，在亚细胞水平直接解析G蛋白偶联受体(GPCR)信号传导的时空调控机制。文章重点介绍了基于构象变化、纳米抗体(Nb)和FRET技术的生物传感器设计策略，以及通过肽抑制剂和纳米抗体实现亚细胞定位特异性信号扰动的方法，为研究非经典GPCR信号（如内体、高尔基体等膜区室起源的信号）提供了关键技术支撑。

　　

引言

作为最大的跨膜(TM)受体家族，G蛋白偶联受体(GPCR)通过感知光信号、神经递质和激素等调控多种生理功能。传统认为GPCR仅通过质膜启动信号，但新证据表明其在核内体、高尔基体和内质网等亚细胞区室中也能介导独特信号事件。这种时空特异性信号传导受膜脂组成、效应分子定位和受体运输的精密调控，而基因编码分子工具的出现为解析这一复杂过程提供了革命性技术手段。

基因编码荧光生物传感器

GPCR与G蛋白动态监测

基于GPCR激活时TM6结构域旋转的特性，研究者开发了两种核心传感器：将CFP/YFP FRET对分别插入第三胞内环和C端（图1a），或在TM5/6间嵌入环状排列荧光蛋白(cpFP)（图1b）。后者衍生的dLight、GRABDA等传感器能以>500%动态范围实时监测多巴胺等神经递质。纳米抗体技术则通过Nb80-GFP特异性结合激活态β₂AR（图1c），首次揭示了内体GPCR信号的存在。

G蛋白异源三聚体与GPCR的动态耦合通过SPASM传感器实现精准解析——该设计用刚性ER/K螺旋连接受体与Gα亚基，两侧分别标记CFP/YFP（图1e），克服了传统双分子FRET传感器表达失衡的缺陷。而Nb37纳米抗体通过识别Gα_s的α螺旋域(AHD)开放构象，意外发现肾上腺素刺激后内体存在延迟的Gα_s激活。

下游效应分子监测

cAMP传感器主要基于Epac蛋白的铰链式构变设计：FRET版本如ICUE将Epac夹在CFP/YFP间（图2a），单FP版本如H188则通过cpGFP环境敏感特性实现检测。膜微区研究显示，Lyn-CAAX靶向的脂筏区基础PKA活性显著高于KRAS靶向的非筏区（图4a）。

激酶活性报告分子采用"底物肽-磷酸结合域"模块化设计。ExRai-AKAR2将PKA底物与FHA1域分置cpGFP两端，通过400/500 nm双激发峰比率变化实现超高灵敏度检测，成功应用于小鼠视觉皮层成像。类似设计的EKAR则揭示β₂AR通过内体Gα_s（而非质膜）激活核ERK信号的独特途径（图4b）。

基因编码扰动工具

肽抑制剂

Gα_sCT（Gα_sC端83肽段）通过竞争性占据GPCR耦合界面阻断信号（图3a）；GRKct则模拟GRK与Gβγ结合域，抑制受体脱敏（图3b）。而源自PKI蛋白的5-24肽段通过"三明治"结构稳定结合PKA催化亚基Tyr²³⁵/Phe²³⁹，实现特异性抑制（图3c）。

纳米抗体技术

Nb80不仅能检测β₂AR活性（图1c），过表达时还可通过占据Gα_s结合位点阻断信号（图3d）。研究者创新性地将FKBP/FRB二聚化系统与Nb80联用（图3f），证明高尔基体β₁AR通过局部产生cAMP调控心肌细胞PLCE-EPAC复合物形成，为心衰治疗提供新靶点。

时空调控机制解析

内体GPCR信号被证实具有独特生物学效应：β₂AR内体池通过持续cAMP信号诱导CREB磷酸化和PKA催化亚基核转位，而质膜信号则主要调控瞬时反应。通过FYVE域靶向的Nb37（图3e）证实，内体Gα_s-ERK信号轴选择性调控细胞增殖相关基因，这解释了传统MAPK抑制剂效果有限的原因。

心肌细胞研究则揭示不同膜区室GPCR的功能分工：质膜β₁AR介导快速收缩反应，而肌浆网(SR)定位受体通过OCT3转运儿茶酚胺，激活局部PKA调控钙处理。这些发现促使"区位偏向性药物设计"概念的提出——靶向特定膜区室GPCR可最大化治疗效果并减少副作用。

未来展望

FluoSTEPs技术通过split-GFP11基因编辑实现内源蛋白定位的精准监测，而HaloTag基化学遗传传感器则通过荧光寿命差异实现六通道多重检测。这些技术进步将推动对GPCR信号网络更高时空分辨率的解析，为精准医疗提供新思路。