单细胞水平RNA异构体m6A甲基化异质性解析及其在RNA监控中的作用机制

本研究通过开发m6A-isoSC-seq技术，首次在单细胞和RNA异构体水平系统解析了m6A甲基化异质性特征。研究人员发现错误加工RNA异构体（如内含子多聚腺苷酸化转录本和错误剪接RNA）具有特异性高m6A修饰模式，并通过CDS-m6A衰减（CMD）途径实现降解，揭示了m6A在RNA质量监控中的新机制。该成果为理解表观转录组调控提供了全新视角。

　　

在生命活动的精密调控网络中，RNA修饰如同神秘的密码，其中N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是最丰富的信使RNA修饰。虽然已知m⁶A通过YTHDF2等阅读蛋白促进RNA降解，但其在不同RNA异构体间的分布规律及单细胞水平的异质性仍如雾里看花。更关键的是，细胞如何识别并清除错误加工的RNA分子？这个关乎基因表达质量控制的核心问题尚未完全阐明。

来自中国科学院和广州医科大学的研究团队在《Nature Communications》发表创新成果。研究人员开发了m⁶A-isoSC-seq技术，巧妙结合牛津纳米孔长读长测序和Illumina短读长测序，对10x Genomics单细胞cDNA文库进行平行测序。通过APOBEC1-YTH诱导的C-to-U突变标记m⁶A位点，首次实现了单细胞分辨率下全长RNA异构体的m⁶A修饰图谱绘制。研究包含三个关键技术：增强型DART-seq（eDART-seq）提高编辑效率；单细胞双平台测序策略确保数据准确性；创新性开发突变峰（mutation peak）分析方法解决单碱基分辨率局限。

研究结果揭示：
【eDART-seq改进m⁶A鉴定】通过添加copGFP标签和T2A自剪切肽，使C-to-U突变位点数量达到原始DART-seq的4.9倍。突变位点78.5%位于腺苷下游1bp，但仅14%位于已知m⁶A位点，提示需采用区域水平的m⁶A分析策略。

【单细胞水平m⁶A异质性】基于6917个单细胞数据，发现m⁶A特征可独立区分HEK293T、HeLa和HepG2细胞系。甲基化细胞比例（平均50%）与整体m⁶A水平相关性（r=0.82）强于单个细胞甲基化程度（r=0.32），表明细胞间异质性是群体m⁶A水平主要决定因素。

【异构体特异性m⁶A模式】鉴定出507个高甲基化异构体（HMIs）和354个低甲基化异构体（LMIs）。HMIs具有更少外显子（P=4.1×10^-10），且34.6%为HeLa特异性，如EEF1D-202相较EEF1D-223在HeLa中显示更高m⁶A和更低表达。

【错误加工RNA的m⁶A标记】内含子多聚腺苷酸化（IpA）异构体m⁶A水平显著高于对应标准异构体（P=6.2×10^-6），32.1%的截短型IpA异构体在最后外显子含有>200nt编码区。错误剪接RNA（含保留内含子或长内部外显子>400nt）的m⁶A位点距外显子连接处更远，且对METTL3缺失更敏感。

【CMD降解机制】CDS区m⁶A通过核糖体停滞触发CMD途径降解，该过程依赖YTHDF2-DCP2而非UPF1。69.3%的CMD靶基因在最后外显子含有>200nt编码区，与IpA异构体特征高度吻合。

这项研究开创性地揭示了m⁶A通过识别异常外显子-内含子结构（如长内部外显子或最后外显子长编码区）标记错误加工RNA的分子机制。不仅建立了单细胞异构体m⁶A分析的金标准，更发现了独立于NMD的RNA质量监控新途径。特别值得注意的是，CMD机制专门针对含有异常长编码区的转录本，这种"分子标尺"般的识别方式，为理解真核生物如何维持转录组纯度提供了全新视角。该发现对RNA代谢异常相关疾病（如神经退行性疾病和癌症）的机制研究具有重要启示意义。