肠道菌群来源的GlcNAc-MurNAc通过TLR4通路调控宿主肠道稳态的机制研究

本研究揭示了肠道菌群衍生的肽聚糖片段GlcNAc-MurNAc（GM）作为新型Toll样受体4（TLR4）激动剂，通过非经典NOD1/2通路调控宿主免疫应答的分子机制。研究人员通过建立LC-HRMS/MS定量平台，首次发现宿主肠道中富含非典型肽聚糖糖链结构，并证实GM通过TLR4/MD-2复合物触发NF-κB和IRF信号通路，显著缓解DSS诱导的小鼠结肠炎。该发现为理解菌群-宿主互作提供了新视角，为炎症性肠病（IBD）治疗提供了潜在靶点。

　　

肠道微生物与宿主健康的相互作用一直是生命科学研究的核心命题。在众多微生物代谢产物中，肽聚糖（Peptidoglycan, PGN）作为细菌细胞壁的主要成分，其片段被普遍认为是激活宿主先天免疫的关键分子。传统观点认为，PGN主要通过NOD1/2受体发挥作用，但越来越多的证据表明，肠道中存在着大量结构各异的PGN片段，它们可能通过未知机制参与宿主免疫调控。这种认知空白促使研究者思考：自然状态下宿主肠道中究竟存在哪些PGN亚型？这些分子是否通过非NOD途径影响宿主健康？

针对这些问题，新加坡南洋理工大学的研究团队在《Nature Communications》发表了一项突破性研究。通过创新性地建立液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS/MS）分析平台，研究人员系统描绘了宿主肠道PGN组的特征谱，意外发现糖链结构GlcNAc-MurNAc（GM）在肠道PGN库中占据主导地位。随后的机制研究揭示，这种不依赖NOD1/2活性的二糖竟能通过TLR4/MD-2复合物触发免疫反应，并在小鼠结肠炎模型中展现出显著的保护作用。

研究主要采用四大技术体系：1）优化LC-HRMS/MS方法定量分析宿主样本中的胞壁酸（MurN）及PGN亚型；2）化学合成标准品验证天然PGN结构；3）利用基因编辑细胞（如Tlr4^-/-）和报告系统（HEK-Blue?）解析信号通路；4）建立DSS诱导的结肠炎模型评估GM的体内功能。此外，研究还整合了表面等离子共振（SPR）、RNA测序和流式细胞术等多维技术。

Muramic acid分析实现宿主可溶性PGN的全局定量
通过酸水解释放PGN的特征组分胞壁酸（MurN），建立平行反应监测（PRM）定量方法。结果显示，特定无病原体（SPF）小鼠盲肠和粪便中MurN含量显著高于无菌（GF）小鼠，健康人粪便中MurN存在个体差异，而血清平均浓度约200 nM，与胎儿牛血清（FBS）相当。该方法首次提供了肠道菌群来源PGN在宿主体内的定量图谱。

糖链结构是宿主肠道PGN的主要亚型
全扫描（FS）和数据依赖性质谱（FSddA）分析揭示，人类粪便中PGN以糖链结构（如MurNAc、1,6-脱水-MurNAc和GM）为主，占比近90%，而典型胞壁肽（含茎肽结构）仅零星检出。值得注意的是，血清中仅检测到单糖组分，暗示PGN的系统性传播具有选择性。跨上皮转运实验证实，GM等糖链比大分子胞壁肽更易穿过肠屏障。

GM通过非NOD机制表现免疫活性
在HEK-Blue? NOD报告系统中，GM不激活NOD1/2，但在RAW264.7巨噬细胞、骨髓来源树突细胞（BMDCs）等免疫细胞中，能剂量依赖性地诱导TNF-α和IL-6等促炎因子表达。这种活性不被多粘菌素B中和，且未检测到糖苷酶降解产物，证实其源于完整二糖结构。

TLR4介导GM触发的免疫应答
抑制剂筛选实验显示，TLR4特异性抑制剂TAK-242可阻断GM的免疫刺激作用。在RAW-Dual?报告系统中，GM激活TLR4依赖的NF-κB和IRF双通路，而Tlr4^-/-细胞完全丧失响应。RNA测序进一步证实，GM在野生型BMDMs中显著上调Il12a/b、Ccl5等细胞因子基因，这些变化在Tlr4^-/-细胞中消失。SPR分析测得GM与TLR4的结合常数K_d≈383 μM，证实其直接相互作用。

GM通过TLR4依赖性机制缓解结肠炎
在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，GM腹腔注射（10 mg/kg）显著减轻体重下降和结肠缩短，降低结肠组织CD45⁺免疫细胞浸润，并抑制Tnfα、Il1β等炎症因子表达。这些保护效应在Tlr4^-/-小鼠中完全消失，证实TLR4是GM发挥功能的关键介质。

这项研究颠覆了传统认知，首次确立肠道菌群来源的PGN糖链可作为TLR4天然配体。其科学意义体现在三方面：1）建立PGN组学分析新范式，揭示宿主肠道PGN的真实组成；2）发现TLR4感知PGN糖链的新机制，拓展了对菌群-宿主对话的理解；3）阐明GM通过TLR4发挥肠道保护作用，为IBD等炎症疾病提供了新型干预策略。特别值得注意的是，GM作为温和的TLR4激动剂，既能适度激活免疫又不引发过度炎症，这种特性使其在治疗应用上比强效激动剂（如LPS）更具优势。未来研究可进一步探索GM与其他免疫通路的交叉调控，以及其在菌群失衡相关疾病中的治疗潜力。