Rad52 C端大片段作为分子伴侣调控Rad51核蛋白丝形成与稳定的分子机制

本研究揭示了酵母Rad52蛋白C端85个残基片段通过折叠结合Rad51单体，竞争性抑制Rad51寡聚化并促进功能性核蛋白丝组装的分子机制。研究人员综合运用NMR、SAXS和AlphaFold2建模等结构生物学技术，发现Rad52通过三个保守基序（含FVTA和YEKF模体）协同结合Rad51多聚化界面，在体内外实验中证实该相互作用对Rad51丝的形成和抵抗Srs2解旋酶活性具有双重调控作用，为理解同源重组(HR)中Rad51动态平衡提供了新范式。

　　

在维持基因组稳定的战斗中，同源重组(HR)是细胞修复DNA双链断裂的核心机制。这场修复的关键步骤依赖于Rad51蛋白在单链DNA(ssDNA)上形成核蛋白丝，执行同源搜索和链入侵。然而这个精密过程面临双重挑战：既要克服RPA蛋白对ssDNA的竞争性结合，又要抵御Srs2解旋酶对Rad51丝的破坏。在酵母中，Rad52蛋白作为关键调控因子协调这一平衡，但其分子机制长期未明。

来自法国巴黎萨克雷大学、居里研究所等机构的研究团队在《Nature Communications》发表研究，通过多学科方法揭示了Rad52调控Rad51丝组装的精细机制。研究发现Rad52 C端一个进化保守的85残基片段能折叠成特定结构，像"分子胶水"般紧密结合Rad51单体。这种结合不仅阻止了Rad51的无效寡聚，还形成保护罩抵抗Srs2的破坏，为理解HR修复的精确调控提供了新视角。

研究主要运用了以下关键技术：核磁共振(NMR)分析Rad52 C端结构动态性、小角X射线散射(SAXS)解析复合物构象、AlphaFold2多聚体建模预测相互作用界面、体内共免疫沉淀验证关键残基、功能荧光标记Rad51-iGFP实时观测丝状结构形成，以及经典的酵母遗传学分析。

一个完全无序的Rad52 C端结构域通过中心85残基片段与Rad51相互作用
通过¹⁵N标记NMR分析，发现Rad52(206-471)呈现典型无序蛋白特征。加入Rad51后，中心区域(310-394)信号显著减弱，该区域包含三个真菌保守基序：含FVTA的模体1(312-322)、模体2(337-367)和含YEKF的模体3(371-392)。序列比对显示这些基序在酵母科中高度保守。

Rad52-Cter解离Rad51寡聚体并与单体形式结合
SEC和SAXS分析显示，Rad52(295-394/408)与Rad51形成1:1复合物(68kDa)，同时解离原有的Rad51四聚体(169kDa)。Kratky图分析表明复合物具有延展构象，保留部分柔性。

Rad52(310-394)结合Rad51时折叠并覆盖广泛保守表面
AlphaFold2预测的模型与实验数据高度吻合(pLDDT=84.9)，显示Rad52(310-394)像"分子安全带"包裹Rad51(77-400)的C端结构域，形成3003?²的接触面。关键残基F316(锚点1)、F337(锚点2)和Y376(锚点3)分别占据Rad51多聚化界面和相邻区域。

突变验证确认模型可靠性
对预测的界面残基(F316/V317/T318等)进行系统突变，共免疫沉淀显示埋藏面积>40%的突变体均严重削弱相互作用(R=0.76)。MMS敏感性实验表明，完全丧失互作的突变体表现出不同程度的DNA损伤敏感，但表型弱于rad52Δ，说明Rad52其他功能保持完整。

Rad52(310-394)通过协同锚点竞争Rad51寡聚化
结构分析揭示锚点1(F316)模仿Rad51自身寡聚化模体(F144VTA)，而锚点2(F337)延伸该相互作用。NMR滴定显示单个锚点突变(F316A/F337A/Y376A)仅削弱局部结合，而三突变体(FFY_AAA)完全丧失结合能力。SEC证实突变体失去解离Rad51寡聚体的能力。

体内实验揭示锚点1和2主导Rad51丝形成
锚点突变体在γ射线和HO诱导DSB修复中呈现梯度表型：rad52-F316A>F337A>Y376A。ChIP显示锚点1/2突变使Rad51在DSB位点招募降低21-33倍，而锚点3突变仅降低2倍。荧光显微镜观察Rad51-iGFP发现，锚点1/2突变体主要形成微弱焦点，而锚点3突变在srs2Δ背景下可恢复丝状结构形成。

Rad51界面残基突变反向验证功能
rad51-K214M(对应锚点2)完全破坏Rad52互作，导致严重MMS敏感且不受srs2Δ挽救。rad51-T161R(对应锚点3)则完美模拟rad52-Y376A表型：轻微影响Rad51招募，但完全依赖Srs2活性，在srs2Δ背景下恢复焦点强度。

这项研究首次完整揭示了Rad52作为"组装分子伴侣"的双重功能机制：通过N端寡聚化域提供多价结合平台，C端无序区域则像"智能绳索"协同捕捉Rad51——锚点1/2负责解开Rad51寡聚体并促进丝状成核，锚点3则维持丝稳定性抵抗Srs2破坏。这种分工协作模式与人类BRCA2的BRC重复区功能异曲同工，但Rad52通过单个扩展结合位点实现更复杂的调控。

该发现不仅解释了酵母HR修复的核心调控机制，更为理解癌症相关蛋白BRCA2/RAD51的互作提供了进化视角。特别值得注意的是，研究揭示的"竞争性结合"策略可能普遍存在于DNA修复系统中，为开发靶向Rad51丝组装的小分子药物提供了新思路。技术层面，研究开创性地将AlphaFold2预测与NMR/SAXS实验验证相结合，为研究固有无序蛋白(IDP)的相互作用建立了范式。