细菌最小RNase P的tRNA加工结构基础揭示分子标尺机制与双功能活性

本研究针对细菌中独特的蛋白型RNase P酶（HARP）的tRNA前体加工机制展开。通过冷冻电镜技术解析了HARP十二聚体与五种pre-tRNA复合物的高分辨率结构，首次发现该酶通过寡聚化形成十二个活性位点，其中五个负责经典的5'-前导序列切割，七个空置位点意外具有3'-尾序列切割功能。研究揭示了HARP通过识别tRNA接受茎5'端与TψC环的固定距离实现分子标尺功能，并证实其通过寡聚化获得双功能活性，为理解小型蛋白的进化适应提供了新视角。

　　

在生命活动的中心法则中，tRNA（转运RNA）作为蛋白质合成的关键适配器，其成熟过程需要精确的加工处理。前体tRNA（pre-tRNA）必须经过5'-前导序列和3'-尾序列的切除才能获得功能，这一过程在原核生物中主要由核糖核酸酶P（RNase P）完成。传统认知中，RNase P分为RNA-蛋白质复合物型和蛋白型两大类，而极端嗜热菌Aquifex aeolicus等生物体内发现的HARP（Homolog of Aquifex RNase P）作为最小的蛋白型RNase P（仅23kDa/单体），其工作机制长期存在两大谜团：一是如何通过寡聚化实现功能，二是为何需要形成十二聚体结构。

日本研究团队在《Nature Communications》发表的研究通过冷冻电镜技术，首次捕获了HARP十二聚体与五种pre-tRNA的复合物结构（分辨率2.87-3.19?）。研究发现：1）十二聚体采用六聚体双层的"六芒星"组装模式，交替排列识别二聚体（负责结合tRNA肘部区域）和催化二聚体（含活性位点）；2）通过精氨酸残基（Arg102/109/125/129等）特异性识别TψC环磷酸骨架，形成分子标尺精确测量5'切割位点与tRNA肘部的距离；3）活性中心采用保守的Asp7-Asp160酸性残基簇协调两个Mg²⁺离子，遵循与其他RNase P相似的双金属离子催化机制。

最突破性的发现是HARP具有双功能活性：五个活性位点进行经典的5'-前导序列切割，而七个空置位点意外展现出3'-尾序列切割能力。质谱分析证实3'-切割发生在接受茎末端下游至少13nt处，且该活性依赖相同的催化残基。这种功能分配模式解释了十二聚体结构的进化意义——通过寡聚化产生的"冗余"活性位点获得了新功能。研究还发现3'-切割具有序列依赖性（偏好腺苷酸下游）且需要tRNA整体结构，不同于单独RNA底物的处理。

关键技术包括：1）冷冻电镜解析HARP十二聚体与pre-tRNA复合物结构（AaHARP 2.87?，HtHARP 3.19?）；2）磷硫酰化修饰pre-tRNA提高复合物稳定性；3）荧光偏振分析定量突变体结合能力；4）变性凝胶电泳结合质谱鉴定切割产物。

研究结果部分：
Cryo-EM structures of HARP:pre-tRNA complexes
冷冻电镜结构显示十二聚体采用左旋超螺旋组装，每个双层结构结合五个而非预测的十个pre-tRNA，产生七个空置活性位点。识别二聚体（绿色）与催化二聚体（蓝色）交替排列，后者同时接触相邻两个pre-tRNA的5'区域。

pre-tRNA recognition by HARPs
通过Arg102/109/125/129等残基与TψC环磷酸骨架的相互作用实现特异性识别，荧光偏振实验证实这些残基突变使结合亲和力降低10倍以上。催化二聚体的Lys99/Arg123则识别接受茎区域。

Catalytic mechanism of HARPs
活性中心包含Asp7/138/142/160和Glu141组成的酸性残基簇，突变分析显示D142N和S139A完全丧失活性，证实其参与金属离子配位。HtHARP结构中观察到两个Mg²⁺离子，支持双金属催化机制。

AaHARP processes the pre-tRNA 3'-trailer
发现HARP可切割3'-尾序列产生13-16nt的短尾产物，质谱鉴定切割位点位于+85/+86（距接受茎末端13nt）。该活性需要tRNA整体结构，且催化突变体（D7N等）同时丧失5'和3'切割能力。

这项研究揭示了小型蛋白通过寡聚化实现功能创新的进化策略：HARP通过形成十二聚体不仅解决了单体尺寸不足的物理限制（维持5'加工功能），还意外获得了3'加工的新功能。这种"一石二鸟"的机制为理解极端环境下生物的适应性进化提供了范例，也为设计多功能人工核酸酶提供了新思路。研究还统一了各类RNase P酶的分子标尺机制，尽管其结构迥异（RNA型、真核PRORP型与细菌HARP型），但都通过测量tRNA肘部与切割位点的固定距离实现精确加工，体现了趋同进化的精妙。