慢性基孔肯雅病患者CD4+ T细胞免疫显性表位的鉴定及其在疫苗设计中的意义

本研究通过全蛋白组肽库筛选，首次系统鉴定了慢性基孔肯雅病（CHIKVD）患者中CD4+ T细胞靶向的123个表位，发现E1、nsP1和CP蛋白中的三个免疫显性区域（含核心基序KLSIMRGKKL、IIKYAASKKG和LISAVNKLTMR），并通过HLA结合预测揭示其广泛人群覆盖性。研究构建的CHIKV特异性表位混合池为疫苗开发提供了重要工具，同时发现非结构蛋白表位在甲病毒属中高度保守，为通用疫苗设计指明方向。

　　

在热带地区肆虐的基孔肯雅病毒（CHIKV）通过蚊子传播，感染后30-60%患者会发展为慢性基孔肯雅病（CHIKVD），表现为持续数年的关节疼痛。这种由甲病毒（alphavirus）引起的疾病缺乏特效治疗手段，而CD4⁺ T细胞被发现在慢性炎症中起关键作用——它们会浸润关节组织并加剧炎症反应。然而长期以来，科学家们面临一个关键瓶颈：人类慢性CHIKVD中CD4⁺ T细胞的具体攻击目标始终未被系统揭示，这严重阻碍了疫苗开发和病理机制研究。

为破解这一难题，来自美国拉霍亚免疫学研究所（La Jolla Institute for Immunology）的Rimjihim Agarwal、Daniela Weiskopf团队联合多国研究人员，在《Nature Communications》发表了突破性研究成果。他们通过创新的全蛋白组筛选策略，首次绘制出慢性CHIKVD患者CD4⁺ T细胞表位全景图，并鉴定出三个具有广泛HLA结合能力的免疫显性核心基序。更引人注目的是，这些发现揭示了甲病毒疫苗设计的新范式——通过靶向高度保守的非结构蛋白表位，可能实现跨病毒株的交叉保护。

研究团队运用三项关键技术：1）基于代表株和变异株设计覆盖CHIKV全蛋白组的992条15肽重叠肽库；2）采用激活诱导标记（AIM）联合FluoroSpot的双重筛选策略，从17名哥伦比亚慢性CHIKVD患者PBMC（外周血单个核细胞）中鉴定特异性表位；3）通过体外扩增T细胞系结合14残基重叠肽精细定位表位核心区域。所有实验均设置6名尼加拉瓜血清阴性对照，并通过HLA分型（采用二代测序技术）和Luminex血清学验证样本特征。

Results
Experimental design for proteome-wide screen of CHIKV T cell epitopes
研究人员设计了一套精妙的筛选方案：将CHIKV的4个非结构蛋白（nsP1-4）和5个结构蛋白（CP、E3、E2、6K、E1）分解为10个肽段混合池（MP），包含代表株的741条肽段和251条变异肽段。通过检测OX40⁺CD137⁺和OX40⁺CD40L⁺双标记的CD4⁺ T细胞，发现88%患者存在应答，其中E1蛋白应答频率最高（65%）。

Identification of CHIKV human CD4⁺ T cell epitopes
经过795次供体/MS组合测试，最终鉴定出123个代表株表位和24个变异表位。值得注意的是，75%预测能结合HLA II类分子的肽段中，17%被实验证实为真实表位，且表位肽的预测结合HLA等位基因数量显著多于非表位肽（p<0.0001）。

Immunodominant proteins in CHIKV proteome recognized by CD4⁺ T cells
表位分布呈现明显偏向性：E1（24%）、nsP1（21%）和CP（16%）包揽61%的表位，且贡献了74%的应答强度（E1单独贡献35%）。免疫显性分析显示nsP1_226-235和E1_1126-1140区域应答频率超过20%阈值。

Immunodominant epitopes in CHIKV proteome recognized by CD4⁺ T cells
38个表位贡献了75%的IFNγ应答强度，其中E1_1126-1140（IIKYAASKKGKCAVH）被9/10供体识别，nsP1_221-235（RRGKLSIMRGKKLKP）和CP_41-55（LAQLISAVNKLTMRA）各被5/5供体识别。精细定位实验揭示这三个区域分别包含KLSIMRGKKL、IIKYAASKKG和LISAVNKLTMR核心基序。

Mechanism of immunodominance
HLA结合预测显示惊人结果：E1_1123-1136核心区可结合70%的常见HLA II类等位基因，nsP1_221-235和CP_42-56分别覆盖67%和44%。这种"广谱"结合能力解释了其免疫显性特征，而侧翼对照肽的HLA结合率仅0-11%（p<0.0001）。

Development and validation of an epitope-based CHIKV CD4⁺ T cell MP
基于鉴定结果构建的结构（CHIKV_S，84个表位）和非结构（CHIKV_NS，63个表位）表位混合池，在独立队列验证中成功检测到58%患者的应答。这些表位特异性CD4⁺ T细胞主要呈现效应记忆表型（TEM），并分泌IFNγ、TNFα和IL-2。

Sequence conservation of CHIKV CD4⁺ T cell epitopes
保守性分析发现：非结构蛋白表位在致关节炎甲病毒中保守度达73%（脑炎病毒组60%），其中80%的多供体识别表位符合交叉反应阈值（>67%保守）。相反，结构蛋白表位保守性较低，提示非结构蛋白更适合作为通用疫苗靶点。

结论与意义