ADTnorm：跨CITE-seq数据集的单细胞蛋白质测量稳健整合方法

单细胞多组学技术CITE-seq能同时检测转录组和表面蛋白，但抗体染色变异导致批次效应严重干扰数据分析。研究人员开发了ADTnorm方法，通过非参数策略对齐蛋白表达密度分布的峰谷特征，有效消除技术变异并提升细胞分型准确性。该方法在13个公共数据集上优于14种现有方法，支持COVID-19和造血祖细胞研究中的新表型标记发现，为单细胞蛋白质组学数据整合提供标准化工具。

　　

在单细胞多组学时代，CITE-seq（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing）技术通过抗体衍生标签（ADT）实现了转录组与表面蛋白的同步检测。然而，抗体染色的技术变异导致不同实验间的蛋白表达数据存在显著批次效应，严重阻碍了跨研究数据的整合与比较。现有归一化方法多针对转录组设计，难以处理蛋白数据特有的多峰分布特征，亟需开发专门的计算工具解决这一瓶颈问题。

针对这一挑战，Fred Hutchinson癌症中心与哥伦比亚大学等机构的研究团队在《Nature Communications》发表了ADTnorm方法。该方法创新性地采用非参数策略，通过识别蛋白表达密度分布的负峰、正峰等关键特征点（landmark），利用函数数据分析对齐不同批次的峰谷位置，实现了技术变异的有效消除。研究团队在13个公共CITE-seq数据集上验证显示，ADTnorm在批次校正和细胞分型准确性方面显著优于CLR、Harmony等14种现有方法，其内置的染色质量评分系统还能指导抗体滴定优化。

关键技术方法包括：1）基于13个公共数据集（含COVID-19和造血祖细胞研究数据）的基准测试；2）密度分布峰谷检测与函数数据对齐算法；3）自动化阈值门控（auto-gating）和染色质量评分系统；4）多中心COVID-19队列（剑桥、纽卡斯尔等）的整合分析；5）造血祖细胞132-plex抗体面板的滴定优化评估。

研究结果：
ADTnorm利用非参数策略整合CITE-seq数据集并消除批次效应
通过曲线配准算法识别蛋白表达的负峰、正峰和谷值，ADTnorm将不同批次的密度分布特征对齐，模拟统一实验条件下的数据产出。在PBMC和纯化T细胞混合数据集中，CD3、CD4等标志物的多峰分布成功对齐，UMAP可视化显示批次效应显著降低（Silhouette评分提高32%）。

基准测试显示ADTnorm优于现有方法
与Arcsinh+CLR、DSB等方法相比，ADTnorm在严重细胞类型组成失衡场景下仍保持稳健性。例如在仅含CD8 T细胞的极端批次中，CD19表达异常升高的假阳性现象减少83%，而基于深度学习的sciPENN等方法出现CD8 T细胞与B细胞标记混淆。

自动化门控与染色质量评估
基于谷值位置的自动门控在多数数据集达到85-95%准确率，但CD45RA等低分离度标记的树突细胞分型存在波动。染色质量评分系统量化了抗体性能，在滴定研究中准确识别CD36等低浓度（1/25x）仍有效的抗体，而CD305即使2x浓度仍表现不佳。

COVID-19研究揭示单核细胞标记变化
整合剑桥等三中心的COVID-19数据发现，患者CD14⁺单核细胞中CD38、CD64表达显著上调（p<0.001），DSB归一化方法则掩盖了CD169的差异表达。ADTnorm校正批次后，CD83⁺CD14⁺亚群中这些标记的阳性细胞比例增加2.1-3.3倍。

造血祖细胞研究的应用价值
在Zhang et al.的132-plex抗体面板中，ADTnorm推荐的70个标记与最终选用面板高度重合。阳性比例分析揭示CD47在造血/基质细胞中广泛表达（>90%阳性），而基于log2-fold change的总VI归一化错误显示其无差异表达。

该研究通过ADTnorm建立了单细胞蛋白质组数据标准化新范式，其技术优势体现在三方面：首先，非参数策略克服了抗体染色变异对数据可比性的影响；其次，染色质量评分系统为抗体面板优化提供量化指标；最后，阳性比例分析增强了生物标记发现的可靠性。这些突破为构建跨研究中心、跨技术平台的单细胞蛋白质图谱奠定了基础，在感染免疫、肿瘤微环境等领域具有广泛应用前景。