综述：研究分支型泛素链介导细胞信号传导的新兴工具与方法

这篇综述系统总结了分支型泛素链（branched ubiquitin chains）的研究进展，重点介绍了其复杂结构特征（如K48-K63、K11-K48等异型连接）、组装方法（酶法合成、化学合成、遗传密码扩展技术）以及功能解码工具（质谱分析、双特异性抗体、纳米抗体）。文章揭示了分支型泛素链作为"优先级信号"在细胞周期调控、NF-κB信号通路和p97/VCP依赖性蛋白质量控制中的关键作用，并指出未来需开发更高效的检测手段以探索其全貌。

　　

分支型泛素链：细胞信号传导的复杂密码

引言
泛素化作为真核细胞关键的翻译后修饰，通过E1-E2-E3酶级联反应形成多样化的泛素链结构。其中分支型泛素链因其独特的拓扑结构备受关注——单个泛素分子上同时存在两种以上连接类型（如K48-K63），形成分叉结构。这种架构显著拓展了泛素系统的信号编码能力，但受限于技术瓶颈，其生物学功能长期处于探索阶段。

直观通用的命名体系
为规范研究标准，领域内采用改良的Fushman命名法：从远端到近端书写泛素单元，连接残基用上标标注（如[Ub]₂-^48,63Ub表示K48-K63分支三聚体）。这种系统能准确描述包括突变修饰在内的复杂链结构。

构建分支型泛素链的技术突破
酶法组装
通过截短型泛素（Ub^1-72）或封闭型突变体（Ub^D77）作为核心，分步使用特异性E2/E3组合可构建确定结构的分支链。例如UBE2N/UBE2V1先组装K63连接，再用UBE2K添加K48分支。新开发的"去帽"技术（如OTULIN切除M1帽）更实现了四聚体等复杂结构的延伸。

化学合成与遗传密码扩展
化学方法通过固相肽合成或天然化学连接，在特定位点引入探针或同位素标签。而遗传密码扩展技术利用非天然氨基酸（如BOC-赖氨酸）实现位点特异性修饰，结合点击化学还能产生抗DUB水解的稳定链结构。

解码分支链的分子机制
特异性"阅读器"的发现
亲和纯化-质谱联用技术揭示了ATXN3、USP15等蛋白对K48-K63分支链的特异性识别。这些"阅读器"多参与DNA修复（RFC1）、内吞运输（HIP1）或p97依赖的蛋白处理（ZFAND2B），暗示分支链可能作为紧急信号协调关键生理过程。

去分支化DUB的鉴定
创新的ULTIMAT assay通过质量标记技术，发现MINDY家族和ATXN3能选择性剪切分支链的K48或K63连接。离子淌度质谱（IM-MS）则证实UCHL5对K6-K48分支链的偏好性，这些发现为调控分支信号提供了新靶点。

细胞内的检测革命
质谱技术
"泛素替换策略"（如R54A突变）结合胰蛋白酶消化，可特异性捕获双-diGly修饰的分支肽段。而UbiChEM-MS和Ub-clipping技术通过分析114 Da的质量偏移，量化了细胞内分支链占比（4-7%）。

抗体工具的突破
双特异性K11-K48抗体成功解析了APC/C与UBR4/5组装的不同分支架构。而纳米抗体NbSL3.3Q对K48-K63链的皮摩尔级亲和力，更揭示了其在DNA损伤位点的动态富集现象。

未来展望
尽管已鉴定出K11-K48等少数分支类型，但其余25种潜在结构的生物学意义仍是未解之谜。开发高效合成更长分支链的方法、建立系统性筛选分支酶的工具、探索不同架构（如"主干-分支"方向性）的功能差异，将成为领域突破的关键。这些研究不仅将完善基础理论，更为靶向泛素系统的药物开发（如蛋白酶体抑制剂增效策略）提供新思路。