积雪草提取物调控热机械诱导白蛋白聚集的作用机制及分子基础研究

本研究针对生物制药过程中蛋白质热/机械应力诱导聚集的关键问题，通过积雪草（Centella asiatica）三种溶剂提取物（CEE/CME/CWE）抑制BSA聚集的实验，发现水提物（CWE）虽成分较少但抑制效果显著（聚集速率降低1.64至0.96 h?1），其作用与抗氧化活性相关。结合HR-LCMS、ITC和分子对接（结合能-9.0 kcal/mol），首次揭示绿原酸通过Sudlow位点I/III抑制聚集的分子机制，为天然抗聚集剂开发提供新思路。

　　

在生物制药和神经退行性疾病领域，蛋白质错误折叠聚集始终是困扰科学界的重大难题。无论是生产过程中的机械剪切力、温度波动，还是阿尔茨海默病中的β淀粉样蛋白沉积，蛋白质聚集都会导致功能丧失甚至毒性。传统合成抑制剂常伴随副作用，而印度传统草药积雪草（Centella asiatica）因其神经保护特性引起关注，但其抗聚集的分子机制尚不明确。

为破解这一难题，印度理工学院古瓦哈提分校的研究团队以牛血清白蛋白（BSA）为模型，创新性地模拟生物制药中的"热机械双重应激"环境，系统比较积雪草三种提取物（极性递增的乙酸乙酯CEE、甲醇CME和水CWE）的抗聚集效果。论文发表于《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》，首次揭示水溶性成分通过多靶点协同作用抑制蛋白质聚集的分子蓝图。

研究采用Th-T荧光监测聚集动力学，DLS分析流体力学直径，CD光谱追踪二级结构变化，TEM直观观察聚集体形态。通过HR-LCMS/HPLC鉴定活性成分，ITC定量结合亲和力，并运用分子对接预测关键相互作用位点。

【Aggregation of BSA in the presence and absence of extracts】
Th-T实验显示，纯热应激（60°C）下BSA聚集速率为0.96 h^?1，而热机械联合应激（60°C+剪切）使速率激增78%（1.83 h^?1）。三种提取物均呈剂量依赖性抑制，其中CWE在0.5 mg/mL时使聚集速率降至0.96 h^?1，相当于纯热应激水平。DLS证实CWE处理组粒径最小（~200 nm vs 对照>1000 nm）。

【Conclusions】
CD光谱揭示CWE能维持BSA天然构象（α-螺旋含量保留>55%），TEM显示其抑制纤维状聚集体形成。ITC测定CWE中活性组分与BSA结合常数K_b=2.3×10⁴ M^?1。分子对接发现绿原酸通过疏水作用和氢键占据Sudlow位点I/III（ΔG=-9.0 kcal/mol），而该化合物占CWE总含量的18.7%。

这项研究开创性地证明：1）机械应力会显著加剧热诱导蛋白聚集；2）积雪草水提物通过"结构保护-氧化应激缓解-特异性结合"三重机制发挥作用；3）绿原酸是核心活性成分。该发现不仅为生物制药工艺优化提供天然稳定剂选择，更为神经退行性疾病防治策略开发提供了新的分子靶点。研究建立的"多尺度表征-能量计算"研究范式，为天然产物作用机制解析树立了典范。