TRIM48作为RIG-I信号通路新型负调控因子的高通量筛选与功能机制研究

为解决先天抗病毒免疫中RIG-I信号通路的精确调控机制问题，德国研究团队通过siRNA高通量筛选616个E3泛素连接酶，首次鉴定TRIM48为RIG-I信号的关键负反馈调节因子。研究发现TRIM48通过其E3泛素连接酶活性促进RIG-I降解，从而抑制IRF3/NF-κB核转位和干扰素产生，该成果为抗病毒免疫调控提供了新靶点。

　　

在病毒与宿主的永恒博弈中，细胞如何精准调控抗病毒免疫反应强度始终是核心科学问题。当病毒RNA被胞质传感器RIG-I（Retinoic acid-inducible gene-I）识别后，会触发级联反应激活IRF3和NF-κB转录因子，诱导I型和III型干扰素(IFN)产生。然而，过度激活这种反应会导致宿主组织损伤，因此需要精确的负调控机制。尽管已知TRIM25、Riplet等E3泛素连接酶能正向调控RIG-I，但对抑制性调控因子的系统性探索仍存在空白。

德国癌症研究中心等机构的研究人员通过创新性实验设计，在《Cellular Signalling》发表的研究中，建立了双荧光报告系统A549^{eGFP-IRF3/mCherry-RelA}细胞系，采用高密度细胞芯片技术对616个E3泛素连接酶进行siRNA高通量筛选，结合RVFV^ΔNSs_rluc报告病毒验证，发现TRIM48是调控RIG-I信号的关键负反馈因子。

研究主要运用了四种关键技术：1）构建稳定表达eGFP-IRF3和mCherry-RelA的双报告细胞系，通过高内涵成像定量核转位；2）高密度细胞芯片(HDC²)技术实现高通量siRNA筛选；3）CRISPR/Cas9基因编辑构建TRIM48缺陷型细胞；4）基于Rift Valley Fever病毒(RVFV)的荧光素酶报告系统评估抗病毒效应。

3.1 双报告细胞系的建立与验证
通过顺序慢病毒感染和流式分选，获得稳定共表达eGFP-IRF3和mCherry-RelA的A549细胞系。该模型在仙台病毒感染4小时后可同步捕获IRF3和NF-κB的核转位，为后续筛选奠定基础。

3.2 高通量筛选发现调控因子
在初级筛选中，针对616个E3连接酶的1848个siRNA处理细胞后，通过自动化显微镜定量核质荧光比值。TRIM48在IRF3通道中评分最高（p值最小），NF-κB通道排名第二，提示其强效抑制作用。

3.3 次级筛选验证功能相关性
采用RVFV^ΔNSs_rluc感染模型验证85个初筛候选基因，发现20个基因的敲除均增强抗病毒反应（与初筛表型一致），其中14个基因（包括TRIM48）在三次独立实验中表现稳定。

3.4 TRIM48的功能确认
过表达TRIM48使VSV-GFP病毒滴度升高10倍，而TRIM48缺陷细胞中IFN-β启动子活性增强3倍。Western blot显示TRIM48过表达降低RIG-I蛋白水平，并抑制TBK1（TANK-binding kinase 1）和IKKα/β的磷酸化。

3.5 分子机制解析
关键发现是TRIM48的E3连接酶活性不可或缺：将RING结构域中Cys46突变为Ser（TRIM48-CS）后，其抑制IRF3/NF-κB活性和促进病毒复制的功能完全丧失。环己酰亚胺追踪实验证实TRIM48加速RIG-I蛋白降解，且这种调控具有诱导性——病毒感染后TRIM48表达显著上调，形成负反馈环。

这项研究首次系统绘制了E3泛素连接酶在RIG-I信号中的调控图谱，揭示TRIM48通过K48-linked泛素化降解RIG-I维持免疫稳态的机制。其科学价值体现在三方面：1）为理解抗病毒免疫的"刹车"机制提供新视角；2）TRIM48可能成为过度炎症疾病的干预靶点；3）建立的高通量筛选策略可推广至其他信号通路研究。值得注意的是，与已知负调节因子RNF125相比，TRIM48的诱导性表达特征使其更适于动态调控，这为开发时序特异性免疫调节剂提供了理论依据。未来研究需明确TRIM48对RIG-I的具体泛素化修饰类型及其在病毒感染动物模型中的生理意义。