冻干qRT-PCR试剂在撒哈拉以南非洲地区禽流感和狂犬病分子诊断中的验证与多中心应用研究

这篇研究验证了冻干qRT-PCR试剂（Qscript lyo 1-step）在撒哈拉以南非洲地区禽流感（AIV）和狂犬病（RABV）分子诊断中的性能。通过多中心评估，证明其与液态试剂（如AgPath-ID）的敏感性（DSe）和稳定性相当，且能耐受30°C短期储存，解决了冷链断裂难题。研究为资源受限地区提供了可靠的分子诊断方案，并拓展了冻干技术在传染病检测中的应用潜力。

　　

ABSTRACT
分子诊断技术虽被视为病原体检测的金标准，但其依赖低温储运的特性在撒哈拉以南非洲等基础设施薄弱地区面临挑战。本研究通过系统评估六种商业化冻干试剂，筛选出单反应格式的Qscript lyo 1-step（Quantabio），并验证其在禽流感（AIV）和狂犬病（RABV）诊断中的性能。结果显示，该试剂对H5N1高致病性禽流感（HPAI）和狂犬病病毒（RABV）的检测限（LoD）与液态试剂相当（10^0.5 EID₅₀/100μL），但在非RABV狂犬病毒属（如DUVV、LBV）检测中因引物-模板互补性不足导致灵敏度下降1-2个数量级。通过优化引物设计（如RABV#3 assay），可显著提升对 divergent lyssaviruses 的检出能力。

INTRODUCTION
禽流感（AIV）和狂犬病（RABV）是撒哈拉以南非洲地区最受关注的两种人兽共患病。H5N1高致病性禽流感（HPAI）和H9N2低致病性禽流感（LPAI）对当地家禽业造成巨大经济损失，而狂犬病每年导致约6万人死亡。尽管分子诊断技术（如qRT-PCR）被WOAH/WHO推荐，但液态试剂的冷链需求严重制约了其在热带地区的应用。冻干技术通过去除水分赋予试剂常温稳定性，但此前缺乏系统性验证。

MATERIALS AND METHODS
研究筛选了六种冻干试剂，最终选择Qscript lyo 1-step进行以下评估：

1. 分析灵敏度（ASe）：测试H5N1（EPI_ISL_273845）、H7N1（DQ090029.1）等病毒株的系列稀释液；
2. 诊断灵敏度（DSe）：使用24份AIV临床样本和28份RABV感染脑组织；
3. 稳定性测试：模拟30°C运输条件（10天）和室温长期储存（9个月）；
4. 多中心验证：在马里、塞内加尔等四国兽医实验室进行盲样测试。

RESULTS

• 性能对比：冻干试剂对H5#1 qRT-PCR的Cq值与液态试剂高度相关（r=0.904），但H5#2终点RT-PCR的LoD降低1个log；
• 温度耐受性：30°C储存10天后仍保持稳定（P>0.05），仅Cq值轻微上升；
• 多中心数据：四国实验室的检测结果与参考实验室一致性达92.1%-100%（Cohen’s Kappa），成功实现qRT-PCR技术转移。

DISCUSSION
冻干试剂通过单反应格式（lyosphere）解决了传统多孔板分装导致的重复性问题。值得注意的是，其对长片段扩增（如308 bp的H5#2）和 divergent lyssaviruses 检测的局限性提示需结合靶标特性优化方案。研究还发现，非洲实验室虽首次接触RABV qRT-PCR，但通过标准化操作流程（SOP）快速掌握技术，印证了"One Health"框架下能力建设的可行性。

CONCLUSION
Qscript lyo 1-step冻干试剂为撒哈拉以南非洲提供了摆脱冷链依赖的分子诊断解决方案，未来可通过引物优化拓展至其他传染病检测领域。该研究为全球卫生行动（如FAO的GPA计划）提供了关键技术支撑。