基于新一代测序技术的烟曲霉三唑类药物耐药性预测临床检测方法的开发与验证

（编辑推荐）本研究针对烟曲霉（Aspergillus fumigatus）对三唑类药物（如伏立康唑、泊沙康唑等）耐药性日益严重的临床挑战，开发了一种基于全基因组测序（NGS）的快速检测方法。通过分析cyp51A基因突变与表型耐药（AFST）的关联，该检测特异性达≥95%，可显著缩短传统药敏试验（CLSI M38标准）的耗时，为临床区分微生物耐药与宿主因素导致的治疗失败提供重要依据。

　　

ABSTRACT
烟曲霉对三唑类药物的耐药性上升促使临床更依赖抗真菌药敏试验（AFST），但传统表型检测存在操作复杂、耗时长等局限。本研究开发了基于cyp51A基因型分析的NGS检测方法，通过对109株临床分离株（含CDC和UT Health标准菌株）及14项已发表研究的整合分析，建立了耐药突变数据库。结果显示，该检测对野生型菌株的阴性符合率（特异性）≥95%，可快速鉴别获得性耐药与宿主因素导致的临床耐药。

INTRODUCTION
烟曲霉是侵袭性曲霉病的主要病原体，全球年发病超25万例，死亡率高达80%。三唑类药物通过抑制Cyp51A/B（14-α固醇脱甲基酶）阻断麦角固醇合成，但耐药机制复杂，包括cyp51A启动子区串联重复突变（如TR34/TR46）和编码区非同义突变（如L98H、G448S）。美国CDC数据显示26%临床分离株的MIC值超过流行病学界值（ECV），其中96%存在cyp51A突变。

MATERIALS AND METHODS
研究纳入UCLA、UT Health和CDC的109株菌株，采用Illumina MiSeq平台进行250 bp双端测序。生物信息学分析以AF338659为参考序列，通过Geneious Prime软件检测cyp51A基因突变。表型药敏依据CLSI M38标准，采用几何均值及95%置信区间建立判读标准。

RESULTS

1. 测序验证：34株已知突变菌株的基因型一致性达97%，仅1株TR46突变因覆盖度不足漏检。
2. 质量阈值：≥1.5×10⁶总读长和≥110条组装读长可确保cyp51A基因10×覆盖度。
3. 表型-基因型关联：
   • 伏立康唑/艾沙康唑：突变株PPA为71%/80%，野生型NPA达88%/92%
   • 泊沙康唑/伊曲康唑：野生型NPA高达99%/100%，但突变株PPA仅46%/47%
4. 关键突变：
   • 泛耐药突变：T289A、G448S、Y121F等对4种三唑类均显示>50%耐药率
   • 多态性位点：A9T、I242V等与野生型MIC显著相关

DISCUSSION
该检测可在10天内完成（传统AFST需3-4周），其高特异性对区分微生物耐药与宿主因素至关重要。局限性包括：

1. 对伏立康唑/艾沙康唑中间型MIC（1-2 μg/mL）预测存在小误差
2. cyp51A非依赖型耐药机制（如hmg1突变）需全基因组扩展分析
   未来可通过扩大突变数据库优化性能，为精准抗真菌治疗提供新工具。

ACKNOWLEDGMENTS
感谢UCLA分子微生物学实验室和UT Health真菌检测实验室的技术支持。