嗜热菌L-丙氨酸脱氢酶突变体工程：通过还原胺化高效合成L-丙氨酸衍生物

本研究针对非蛋白源性氨基酸(NPAAs)绿色合成需求，通过活性位点重塑技术对嗜热菌Thermus thermophilus L-丙氨酸脱氢酶(TtAlaDH)进行改造。研究人员聚焦Tyr92残基突变，获得Tyr92Ser突变体，其对α-酮己酸(α-ketocaproate)的催化效率(kcat/KM)提升6.6倍，首次实现L-2-氨基丁酸(43%)、L-正缬氨酸(47%)和L-正亮氨酸(70%)的高效合成，产物对映体纯度>99%。该成果为医药化工领域提供了新型生物催化工具。

　　

在医药和化工领域，非蛋白源性氨基酸(NPAAs)作为重要的手性砌块，广泛应用于药物开发和功能材料制备。传统化学合成法面临反应条件苛刻、环境污染严重等问题，而酶法合成因其绿色高效特性备受关注。L-丙氨酸脱氢酶(L-AlaDH)能催化α-酮酸还原胺化生成L-氨基酸，但其天然底物谱狭窄，难以满足多样化NPAA合成需求。如何突破酶固有的底物限制，成为开发生物催化新工具的关键科学问题。

土耳其科学技术研究理事会(TUBITAK)支持的科研团队，在《International Journal of Biological Macromolecules》发表研究，通过理性设计改造嗜热菌来源的TtAlaDH。研究采用活性位点重塑技术构建突变体文库，结合动力学分析和分子模拟，系统评估了突变体对C4-C6链长α-酮酸的催化性能。

关键技术包括：1) DBK简并密码子介导的定点饱和突变技术构建Tyr92突变库；2) 紫外分光光度法测定酶促反应动力学参数(k_cat和K_M)；3) 分子对接模拟分析突变体活性位点构象变化；4) HPLC手性柱分析产物对映体纯度。

分析突变体文库
通过DBK简并密码子引入12种氨基酸突变，筛选获得Tyr92Ser优势突变体。该突变显著改变了酶活性口袋的空间位阻，为长链α-酮酸底物创造了更优的结合环境。

讨论
相较于野生型酶，Tyr92Ser突变体对α-酮己酸的k_cat提升198倍，虽K_M增加30倍，但整体催化效率仍提高6.6倍。分子模拟显示，丝氨酸残基较小的侧链减少了空间位阻，促进了底物氨基化过渡态形成。值得注意的是，突变体对天然底物丙酮酸的活性降低，证实了底物特异性转变。

结论
该研究首次实现TtAlaDH从"丙酮酸专一性"向"长链α-酮酸偏好性"的转变，建立了C4-C6非天然L-氨基酸的生物合成新途径。所得产物对映体纯度>99%，避免了传统化学合成所需的外消旋体拆分步骤。工程化酶在55°C仍保持稳定活性，展现出良好的工业应用前景。

这项工作的创新性体现在三方面：1) 发现Tyr92是调控L-AlaDH底物选择性的关键"分子开关"；2) 开发出首个能高效合成正缬氨酸等支链氨基酸的AlaDH突变体；3) 为其他氨基酸脱氢酶的改造提供了活性位点设计范式。研究成果不仅丰富了酶工程理论，更为手性药物中间体的绿色制造提供了新方案。