假尿苷修饰RNA通过内溶酶体加工障碍和TLR识别逃避免疫检测的分子机制研究

本研究揭示了假尿苷(Ψ)修饰RNA逃避免疫识别的双重机制：一方面RNase T2和PLD核酸酶无法有效加工Ψ-RNA生成TLR7/8激动剂配体；另一方面TLR8选择性忽略Ψ作为其第一结合口袋配体，而TLR7则忽略Ψ-RNA作为第二口袋配体。值得注意的是，临床应用的N1-甲基假尿苷(m1Ψ)虽能逃逸核酸酶加工，却可直接激活TLR8。该研究为RNA感知TLR的自我规避机制提供了分子基础，对mRNA疫苗设计具有重要指导意义。

　　

在RNA治疗领域，如何避免外源RNA引发的免疫反应一直是重大挑战。2005年Karikó等人的开创性工作发现假尿苷(Ψ)修饰能显著降低mRNA的免疫原性，这一发现直接推动了mRNA疫苗技术的突破。然而近二十年来，Ψ修饰RNA逃避免疫识别的分子机制始终未明。Toll样受体(TLR)7/8作为识别RNA降解产物的关键模式识别受体，其激活需要内溶酶体核酸酶RNase T2和PLD的协同作用。但内源性RNA中普遍存在的Ψ修饰为何能逃避TLR识别？这个基础科学问题对理解免疫耐受和优化mRNA治疗都至关重要。

德国慕尼黑大学等机构的研究人员通过多学科交叉研究，首次阐明了Ψ-RNA免疫逃逸的双重机制：在加工层面，RNase T2和PLD核酸酶对Ψ-RNA的切割效率显著降低；在识别层面，Ψ本身是TLR8的弱激动剂，而Ψ-RNA不能作为TLR7第二口袋配体。研究还意外发现临床使用的m¹Ψ虽能逃逸核酸酶加工，却保留了TLR8激活能力。这项发表于《Cell》的研究为RNA免疫识别提供了全新认知，为设计更安全的治疗性RNA奠定了基础。

研究采用的关键技术包括：1)定量质谱分析RNase切割产物；2)TLR8胞外域二聚化质谱检测；3)原代免疫细胞(单核细胞、pDC)功能实验；4)RNase T2缺陷小鼠模型验证；5)液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测2',3'-cGMP等代谢产物。

RNase T2底物特异性分析

通过设计含GU切割位点的模型底物，结合LC-MS定量分析发现RNase T2严格偏好RU基序切割，而RNase 1则切割YN基序。在复杂RNA底物中，RNase T2几乎只产生R终止片段。结构分析表明RNase T2的B2口袋排斥Ψ和m¹Ψ，而RNase A家族成员能正常处理这些修饰。

Ψ-RNA不激活TLR8

实验证明Ψ或m¹Ψ修饰的长链RNA在多种免疫细胞中均不能激活TLR8。机制研究表明：1)RNase T2无法切割GΨ位点；2)PLD核酸酶对Ψ-RNA的5'端降解效率低下；3)细胞实验显示高浓度Ψ单独不能激活TLR8，但配合ssRNA可诱导弱二聚化，提示其结合能力较弱。

Ψ抑制TLR7激活所需的2',3'-cGMP释放

研究发现Ψ和m¹Ψ修饰RNA无法被RNase T2/PLD有效加工生成TLR7激动剂2',3'-cGMP。在PLD缺陷细胞中，Ψ寡核苷酸不能作为TLR7第二口袋配体。小鼠实验证实RNase T2缺失显著降低未修饰mRNA的IFNα反应。

研究结论指出，Ψ修饰通过"双重保险"机制逃避免疫识别：一是内溶酶体核酸酶加工障碍，二是TLR受体选择性识别规避。特别值得注意的是，虽然m¹Ψ也能逃逸核酸酶加工，但其保留TLR8激活能力的特性提示临床应用中需权衡利弊。该研究不仅揭示了RNA修饰与先天免疫的精细互作机制，还为优化治疗性RNA设计提供了分子指导——通过合理规避RNase T2依赖的加工途径，可设计出更安全的免疫隐形mRNA。这些发现对发展新一代RNA疫苗和核酸药物具有重要指导价值。