CLDN4棕榈酰化驱动肝癌胆管样转化及仑伐替尼耐药机制研究

本研究揭示了CLDN4通过C104/C107位点棕榈酰化修饰稳定脂筏定位，激活CNTN1-Notch信号轴促进肝癌细胞向胆管谱系转化(HBT)，导致仑伐替尼耐药。团队筛选出靶向CLDN4-zDHHC5相互作用的小分子抑制剂SalB，可逆转HBT表型并恢复药物敏感性，为耐药肝癌患者提供了联合治疗新策略。

　　

肝癌作为全球高发恶性肿瘤，其治疗面临严峻挑战。尽管多靶点酪氨酸激酶抑制剂仑伐替尼(Lenvatinib)已成为一线治疗药物，但临床响应率不足20%，耐药机制亟待阐明。肿瘤细胞通过谱系可塑性逃逸药物杀伤的现象日益受到关注，尤其在肝脏发育过程中，肝细胞与胆管细胞本就具备相互转化的潜能。这种被称为肝-胆管谱系转化(HBT)的现象，在混合型肝癌中已有报道，但其在靶向治疗耐药中的作用仍属未知。

复旦大学附属中山医院肝外科团队在《Cell Reports Medicine》发表的研究，首次揭示紧密连接蛋白CLDN4通过动态棕榈酰化修饰驱动HBT，进而导致仑伐替尼耐药的分子机制。研究人员通过构建自发肝癌小鼠模型结合单细胞测序技术，发现CLDN4在耐药患者及细胞系中特异性高表达。进一步实验证实，棕榈酰转移酶zDHHC5介导CLDN4在C104/C107位点的修饰，阻断其K103位点泛素化降解，促进CLDN4在脂筏的锚定。这种空间定位变化招募细胞粘附分子CNTN1至脂筏微环境，持续激活Notch信号通路，最终诱导肝癌细胞获得胆管样表型并产生耐药性。

研究采用的关键技术包括：①自发性和原位肝癌小鼠模型构建；②基于质谱的棕榈酰化修饰组学分析；③单细胞转录组测序(Fu-LR Sc队列)；④分子对接虚拟筛选；⑤患者来源异种移植(PDX)模型验证。临床样本来自55例接受术前仑伐替尼治疗的肝癌患者(Fu-LR队列)和匹配的未治疗对照组。

CLDN4作为克服肝癌仑伐替尼耐药的潜在靶点
通过蛋白质组学与单细胞测序交叉分析，发现CLDN4在耐药组显著富集。免疫组化显示CLDN4膜定位与患者不良预后相关，治疗前活检标本中其表达水平可预测药物响应。

CLDN4水平升高与HBT及仑伐替尼耐药相关
单细胞轨迹分析揭示CLDN4高表达细胞呈现胆管标志物(EPCAM/SOX9)上调而肝系标志物(ALB)下调的特征。类器官实验证实CLDN4过表达可直接诱导HBT表型，敲除后恢复药物敏感性。

棕榈酰转移酶zDHHC5催化CLDN4在进化保守的C104/C107位点发生S-棕榈酰化
质谱鉴定出不同于预测模型的真实修饰位点，AlphaFold3模拟显示zDHHC5通过DHHC基序(131-134位点)与CLDN4特异性结合。临床数据证实zDHHC5-CLDN4轴与不良预后显著相关。

LYPLA2去棕榈酰化CLDN4
发现LYPLA2而非LYPLA1/ABHD17A是CLDN4特异性去棕榈酰化酶，调控其膜定位动态平衡。

CLDN4棕榈酰化是脂筏定位的必要条件
2-BP处理或zDHHC5敲除导致CLDN4经网格蛋白介导的内吞(CME)途径降解。TRIM33被鉴定为介导K63连接泛素化的E3连接酶，与棕榈酰化修饰存在竞争性调控。

CLDN4通过激活Notch通路改变肿瘤细胞可塑性
设计竞争性肽CPP-S4阻断棕榈酰化后，Notch信号显著抑制。染色质免疫共沉淀证实NICD-RBPJ复合物直接调控胆管标志基因启动子活性。

CLDN4驱动CNTN1至脂筏激活Notch
免疫共沉淀显示CLDN4通过纤连蛋白结构域与CNTN1结合，甲基-β-环糊精破坏脂筏可逆转Notch通路的异常激活。

通过虚拟筛选发现CLDN4拮抗剂
从17,681个小分子中鉴定出丹参素B(SalB)能有效抑制CLDN4-zDHHC5相互作用。Zdhhc5^-/-小鼠实验证实其显著延缓自发肝癌进展且无显著毒性。

CLDN4诱导的HBT与肝癌不良预后相关
组织流式分析显示残留病灶中胆管样细胞比例显著增加(34.7% vs 12.1%)。联合化疗可使CLDN4⁺KRT7⁺PDX模型获益，而SalB与仑伐替尼联用显著抑制肿瘤生长。

该研究系统阐明了肝癌靶向治疗耐药的新机制，提出谱系转化作为耐药关键途径的理论创新。临床转化方面，首次将棕榈酰化修饰调控剂应用于耐药逆转策略：①CLDN4表达可作为预测标志物；②SalB提供联合治疗新选择；③为混合型肝癌化疗方案选择提供依据。研究局限性在于HBT过程可能涉及更复杂的微环境调控，且SalB的多靶点特性需进一步解析。这些发现为理解肿瘤可塑性提供了新视角，也为突破肝癌治疗瓶颈开辟了精准医学路径。