基于microRNA响应的ON-OFF混合mRNA开关实现精准蛋白质表达控制

本研究针对mRNA疗法中蛋白质表达缺乏细胞和组织特异性调控的难题，开发了一种新型microRNA(miRNA)响应型ON-OFF混合mRNA开关。通过整合5'UTR的OFF开关模块和poly(A)尾后ON开关模块，该技术能同时感知靶与非靶细胞的特异性miRNA（如miR-302a-5p/let-7b-5p），在体外培养体系和体内小鼠模型中实现高达16.8倍的ON/OFF选择性，为下一代mRNA药物开发提供了精准调控工具。

　　

在mRNA技术快速发展的今天，疫苗开发和细胞功能重建等领域已取得显著进展。然而，如何实现蛋白质表达的精准时空控制仍是重大挑战——特别是在癌症和自身免疫疾病治疗中，脱靶表达可能引发严重副作用。传统mRNA技术像"全开或全关"的灯泡，无法区分不同细胞类型。京都大学和东京大学的研究团队另辟蹊径，从细胞"分子指纹"microRNA(miRNA)入手，开发出能智能识别细胞身份的mRNA开关系统，相关成果发表于《Molecular Therapy Nucleic Acids》。

研究团队采用模块化设计策略，通过体外转录合成m¹Ψ修饰的mRNA，结合流式细胞术评估EGFP/iRFP670荧光比值，并利用IVIS成像系统进行小鼠体内生物发光检测。关键创新在于系统比较了UUUA/CCCA/GGGA等不同3'端额外序列对开关性能的影响，并通过整合5'UTR的miRNA-OFF开关与poly(A)尾后的miRNA-ON开关，构建出单分子双调控系统。

Effects of extra sequences after the poly(A) tail on ON switch design
研究发现仅4nt的UUUA重复序列即可建立有效OFF状态，而添加U6-tract（UUUAUUUA₆-U₆）使ON/OFF比率提升至5.4倍。有趣的是，CCCA重复序列呈现"剂量依赖性"相反效应，增加重复数反而降低开关性能，揭示AU-rich元件在翻译抑制中的关键作用。

ON-OFF hybrid switch to reduce off-target expression and enhance ON/OFF ratio
在hiPSC/HeLa细胞模型中，针对miR-302a-5p(hiPSC高表达)和let-7b-5p(HeLa高表达)设计的混合开关，将OFF状态泄漏降低4-7倍，ON/OFF比率提升至16.8倍。尤其值得注意的是，对弱效miRNA（如miR-98-5p）的响应性也得到显著改善，证明双模块协同效应可补偿单一miRNA活性的不足。

Tissue-selective protein expression in vivo using ON and hybrid switches
通过肌肉注射miR-1a-3p响应型ON开关，首次实现内源性miRNA驱动的体内蛋白质表达调控。更引人注目的是，整合肝特异性miR-122-5p-OFF模块后，混合开关使肌肉/肝脏表达比提升3.1倍；静脉注射实验中，miR-142-3p-OFF/miR-122-5p-ON混合开关成功实现肝脏-脾脏选择性表达。

这项研究突破性地解决了mRNA疗法三大核心问题：首次证实ON型mRNA开关的体内功能；开发出仅需32nt的微型调控模块；通过"双保险"设计将组织选择性提升至新高度。特别值得关注的是，UUUA重复序列的普适性使其成为标准化生物元件，而单分子设计显著简化了治疗性mRNA的生产流程。尽管ON状态表达效率仍有优化空间，但该技术为肿瘤靶向治疗、再生医学等领域提供了可编程工具——就像为mRNA装上了"GPS导航"，使其能精准抵达目标细胞并执行预定指令。未来结合组织特异性递送技术，这种智能开关系统或将开启精准医学新纪元。