3'UTR介导基因表达的定量调控机制及其在转录后调控中的重要作用

研究人员针对哺乳动物基因转录后调控中3'非翻译区(3'UTR)的定量影响机制这一关键问题，开发了精确的大规模平行报告分析系统(MPRA)，评估了1400多个全长人类3'UTR对RNA丰度、稳定性和翻译调控的影响。研究发现3'UTR通过协同调控翻译和衰变来介导基因表达，揭示了GC含量和3'UTR长度与不同调控模式的关系，并鉴定了介导3'UTR依赖性基因表达的RNA结合蛋白(RBP)相关序列基序。该研究为理解3'UTR在基因表达调控中的核心作用提供了全面系统的数据支持。

　　

基因表达调控是细胞功能的基础，在几乎所有生物学过程中都起着关键作用。虽然DNA元件如何控制转录的研究已取得重要进展，但转录后调控机制仍知之甚少。在哺乳动物中，3'非翻译区(3'UTR)是转录本内调控信息的主要来源。3'UTR序列通常具有保守性，与启动子和增强子等其他非编码基因组区域相比，3'UTR中富集了更多可能影响适应性的突变。人类3'UTR通常比其他生物更长，含有更多保守序列元件，这与它们在复杂调控中的作用一致。许多人类基因经历选择性多聚腺苷酸化和切割(APA)，导致产生不同的3'UTR序列。APA是一个高度调控的过程，因为不同细胞类型中会以不同频率使用不同的位点，并与许多生物过程以及人类健康和疾病相关。

为全面理解3'UTR介导的调控，康奈尔大学等机构的研究人员开发了一个系统来监测大量全长3'UTR对基因调控的影响。重要的是，该方法系统地确定了全长3'UTR序列对累积定量调控(即蛋白质输出)的影响，并区分了RNA丰度、RNA衰变和翻译效率对这种总调控的贡献。研究人员利用这些分析来定义影响RNA丰度、翻译和总蛋白质输出的3'UTR特征，为理解3'UTR介导调控的全局范围提供了新见解。相关研究成果发表在《Nucleic Acids Research》上。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：1)开发了基于Bxb1重组酶系统的3'UTR报告基因文库构建方法，实现了在基因组特定位点的高效整合；2)建立了荧光激活细胞分选(FACS)结合高通量测序的MPRA系统，可同时测量数千个3'UTR报告基因的表达；3)采用多核糖体分析技术评估3'UTR对翻译效率的影响；4)利用Tet-Off系统进行启动子关闭实验测定RNA稳定性；5)结合RNA-seq和PRO-seq技术进行转录组水平的RNA稳定性评估。

研究结果部分主要包括以下发现：

"一个大规模平行报告分析系统评估3'UTR介导的基因调控"
研究人员开发了一个准确的大规模平行报告分析(MPRA)系统来评估全长人类3'UTR对基因表达的定量影响。该系统利用GFP报告基因与感兴趣的3'UTR融合，整合到基因组中确定位点，并通过包含的条形码序列在报告基因文库中识别每个3'UTR。通过FACS将表达3'UTR报告基因库的细胞根据GFP荧光分成不同区间，然后从每个区间的细胞中扩增条形码并进行测序，从而能够同时测量每个报告基因在不同区间的相对比例，进而确定蛋白质输出。该系统具有启动子、5'UTR和编码区恒定不变的优势，可以将调控完全归因于3'UTR。

"确定3'UTR对RNA丰度和翻译效率的调控影响"
研究发现RNA丰度和翻译效率之间存在显著相关性(ρ=0.62)。通过多元线性回归模型分析发现，RNA丰度和翻译效率共同解释了蛋白质表达变异的76.4%。值得注意的是，在去除RNA丰度影响后，翻译效率可以单独解释蛋白质水平变异的21.1%，而RNA丰度仅能解释10.0%，表明翻译可能在3'UTR调控中发挥更主要的独立影响。研究人员还发现了一类特殊的3'UTR，它们表现出非常低的RNA丰度但明显高的翻译效率，导致相对较高的蛋白质输出。

"3'UTR MPRA测量反映内源基因的转录后调控"
研究人员将MPRA测量的RNA丰度与内源基因的RNA稳定性进行比较，发现两者之间存在显著相关性。这表明3'UTR MPRA确实能够捕获内源基因位点在其完整序列背景下表达的调控信息。此外，PRO-seq数据显示只有2.5%的3'UTR报告基因序列在其同源内源序列中含有增强子，这一比例与在所有3'UTR中检测到的比例(2.1%)相当，表明3'UTR序列不太可能作为传统增强子发挥作用。

"与3'UTR介导调控相关的特征差异影响RNA和翻译"
研究发现GC含量与蛋白质输出呈负相关(ρ=-0.33)，即高AU含量对应更高的蛋白质输出。GC含量与翻译效率也呈负相关(ρ=-0.24)。有趣的是，GC含量与RNA丰度的关系呈抛物线型，约50%GC含量的3'UTR具有最低的RNA丰度，而高或低GC含量都与较高水平相关。3'UTR长度与总蛋白质输出(ρ=-0.32)、翻译效率(ρ=-0.40)和RNA丰度(ρ=-0.30)均呈负相关。当限制分析到可能缺乏调控元件的非保守序列时，也观察到类似模式，表明3'UTR长度至少在部分程度上以元件非依赖的方式介导抑制。

"鉴定通过3'UTR控制基因表达的转作用因子"
通过小RNA测序(sRNA-seq)和miRNA靶向分析发现，miRNA在定量3'UTR介导调控中可能只起次要作用。相比之下，研究人员使用Transite程序进行谱基序富集分析(SPMA)，鉴定出许多RBP基序与低(slope<0)或高(slope>0)蛋白质评分的3'UTR相关。例如，ELAVL1(HuR)、ELAVL2和ELAVL3的基序在具有高蛋白质评分的3'UTR中富集，而RBM4/RBM4B和YBX1的基序在低表达3'UTR中富集。利用公开的ELAVL1 eCLIP-seq数据进一步验证发现，含有ELAVL1结合位点的3'UTR报告基因确实具有更高的蛋白质输出。

"启动子身份对3'UTR介导的转录后调控的影响"
研究发现当3'UTR报告基因由不同启动子(PGK或CAG)控制时，其行为存在显著差异。通过建立多个独立的单克隆细胞系，研究人员确认3'UTR报告基因的差异是可重复的，表明启动子很可能是介导这些调控变化的主要原因。SPMA分析发现许多RBP基序在差异调控的3'UTR中富集，提示启动子可能通过促进RBP加载来影响后续的转录后调控。特别是ELAV家族蛋白的基序在PGK细胞系中比CAG细胞系中更多与3'UTR介导调控相关。

研究结论部分强调，这项工作设计、优化并实施了一系列分析方法，在大规模上定量评估3'UTR对基因调