基于R2Tg逆转录转座子的全RNA系统在DNA靶向插入中的结构引导工程与应用

本研究针对基因插入技术中存在的随机整合和外源DNA依赖等问题，开发了基于Taeniopygia guttata来源的R2逆转录转座子(R2Tg)的全RNA基因插入系统。通过结构生物学和生化研究揭示了R2Tg识别假结RNA元件启动靶向引物逆转录(TPRT)的分子机制，并成功将系统尺寸缩小至67nt 3'UTR，通过5'端化学修饰和脂质纳米颗粒(LNP)递送使多种人类细胞系的整合效率提升至80%以上。该研究为基因治疗提供了无需DNA组件的安全高效工具。

　　

基因组编辑领域长期面临两大技术瓶颈：一是现有基因插入系统如CRISPR-Cas9依赖外源DNA组件，可能引发免疫反应和随机整合风险；二是传统方法难以实现大片段DNA的精准靶向插入。非LTR（长末端重复序列）逆转录转座子R2因其独特的"复制-粘贴"机制和28S核糖体RNA基因靶向性，被视为潜在的解决方案。然而，R2元件作用机制不清、插入效率低下等问题制约了其应用。

由哈佛-麻省理工学院Broad研究所等机构组成的联合团队在《Nature Communications》发表研究，通过冷冻电镜(cryo-EM)解析了斑胸草雀(Taeniopygia guttata)来源的R2Tg蛋白复合体结构，发现其通过3'UTR假结RNA元件启动靶向引物逆转录(TPRT)。基于结构指导，研究人员成功开发出仅含67nt核心元件的全RNA基因插入系统，经5'端锁核酸帽修饰和LNP递送优化后，在多种人类细胞系实现超过80%的整合效率。

关键技术包括：冷冻电镜解析R2Tg-核酸复合体3.2?结构；体外TPRT活性检测系统；化学修饰RNA合成技术；脂质纳米颗粒递送优化；高通量整合位点测序分析(TTISS)；纳米孔长读长测序验证等。

研究结果

天然R2Tg在人类细胞中的活性
通过比较R2-A、-C、-D进化枝的7种直系同源物，发现斑胸草雀R2Tg在HEK293FT细胞中活性最高，能特异性靶向28S rRNA基因位点。不同于家蚕R2Bm，R2Tg对靶DNA的CpG甲基化不敏感，具有更广的应用潜力。

R2Tg TPRT活性的生化特征
体外实验表明R2Tg需40nt 3'同源序列启动TPRT，且能高效切割双链DNA（底链92%、顶链86%）。竞争实验揭示TPRT过程中存在构象变化：底链切割后R2Tg与DNA紧密结合不可交换，而顶链切割状态可被未标记DNA竞争抑制。

R2Tg启动TPRT的结构基础
冷冻电镜结构显示R2Tg通过RT-1结构域识别3'UTR假结RNA，该元件含三个碱基三联体，与R2Bm相比具有更扩展的有序区域。锌指结构域(ZnF1)和RT6a环通过不同氨基酸残基识别28S DNA的Retrotransposon Upstream Motif(RUM)，解释了物种间靶向特异性差异。

DNA插入的紧凑RNA系统工程
将天然系统拆分为编辑器（R2Tg mRNA）和供体（含GFP报告基因的RNA），发现：

• 删除5'UTR可使插入瘢痕减少1kb
• 保留100nt 3'UTR时效率最高（较全长提升1.66倍）
• 仅需4nt 3'同源性和28nt 5'同源性即可有效整合
• 系统可承载长达3kb的外源基因，但效率随尺寸增加而降低

供体RNA化学修饰与递送优化
对比不同修饰策略：

• N¹-甲基假尿苷(m¹Ψ)修饰优于假尿苷(Ψ)和尿苷(U)
• 5'锁核酸帽(modCap)使效率提升2倍
• 3'多尾(MT)修饰提升1.8倍
• LNP递送较脂质体(MMax)效率提高4倍

R2Tg介导整合的特征
TTISS测序显示>99%整合发生在28S或其高度同源位点。纳米孔测序揭示53.4%为全长整合，ddPCR估算平均每个基因组含3.8个整合拷贝。在15种哺乳动物细胞测试中，AC16、HeLa和HEK293FT效率超80%，原代T细胞达0.4%。

讨论与意义
该研究首次解析了R2-A进化枝逆转录转座子的工作机制，突破性地实现了：
1）通过结构指导的最小化RNA系统设计，将必需元件缩减至67nt 3'UTR假结结构；
2）建立不依赖DNA组件的基因插入平台，避免了外源DNA引发的免疫反应；
3）开发适用于原代细胞的LNP递送方案，为体内应用奠定基础。

局限性包括大片段（>3kb）整合效率下降，以及R2Tg内切酶活性导致的细胞增殖抑制。未来可通过融合降解标签或小分子抑制剂调控蛋白活性，或替换Myb/ZnF结构域为CRISPR系统实现重靶向。这项技术为遗传病治疗、CAR-T细胞改造等应用提供了新工具，其模块化设计也便于整合新兴的RNA修饰技术。