大肠杆菌中磷酸化及功能性αs1-酪蛋白的生产：动物源性乳蛋白替代的新策略

本研究针对微生物系统生产酪蛋白的关键瓶颈——磷酸化修饰缺失问题，通过创新性策略实现了功能性重组αs1-酪蛋白的微生物合成。研究团队采用枯草芽孢杆菌激酶PrkD/YabT实现位点特异性磷酸化，并开发磷酸模拟突变体（phosphomimetic substitution），质谱与双向电泳证实其成功模拟天然磷酸化模式。功能实验显示重组蛋白具有钙结合能力与结构拟态性，为无动物源乳制品创新奠定基础。该成果发表于《TRENDS in Biotechnology》，为可持续食品工业提供关键技术突破。

　　

乳制品作为人类重要营养来源，其核心成分酪蛋白因独特的磷酸化特性形成胶束结构，赋予乳品功能特性。然而传统畜牧业面临环境压力与伦理争议，微生物合成成为理想替代方案。但酪蛋白需通过磷酸化修饰（尤其是丝氨酸残基）形成磷酸中心（PCs）结合钙离子，这一过程在原核宿主中难以实现，成为工业化生产的主要障碍。

针对这一挑战，丹麦技术大学与瑞典查尔姆斯理工大学的研究团队在《TRENDS in Biotechnology》发表突破性研究。他们通过两种创新策略实现功能性α_s1-酪蛋白的微生物生产：一是利用枯草芽孢杆菌激酶PrkD/YabT进行体内外磷酸化；二是将8个潜在磷酸化位点替换为天冬氨酸（phosphomimetic策略）。研究采用液质联用（LC-MS）验证磷酸化位点，双向电泳（2DE）分析蛋白异构体，结合钙结合实验、荧光光谱和动态光散射（DLS）等多维度表征技术。

表达与磷酸化验证
通过工程化改造，PrkD和YabT激酶在体外成功磷酸化α_s1-酪蛋白所有9个天然位点。体内共表达实验显示，重组蛋白产生4-5种异构体，磷酸化程度与商业牛源酪蛋白相当。磷酸模拟突变体（Ra_s1-PM）通过负电荷模拟磷酸化状态，简化了生产流程。

功能特性分析
消化实验表明所有重组酪蛋白在模拟胃肠环境中完全降解，符合食品应用要求。关键发现显示：磷酸化变体的钙结合能力显著高于非磷酸化形式（p<0.0001），而磷酸模拟体表现更优——天冬氨酸的稳定负电荷增强静电相互作用。荧光光谱揭示磷酸化诱导色氨酸微环境变化，暗示构象调整；DLS证实磷酸化蛋白形成12 nm寡聚体，接近天然状态。

技术突破与产业意义
该研究首次实现微生物系统生产具有天然磷酸化模式的功能性酪蛋白，技术成熟度（TRL）达4级。磷酸模拟策略降低代谢负担，而激酶共表达系统可精确调控磷酸化水平，为定制化乳蛋白生产提供可能。尽管非天然磷酸化位点存在影响，但该成果解决了乳制品替代领域的关键科学问题，推动无动物源乳蛋白商业化进程。

研究团队指出，未来需验证重组酪蛋白形成钙磷酸盐纳米簇（CCP）的能力，并优化分泌表达系统。这项工作不仅为可持续食品工业提供新范式，其激酶工程策略还可拓展至其他需要复杂翻译后修饰的蛋白生产领域。