无载体气道内靶向表观遗传编辑技术的突破性研究：实现体内特异性DNA去甲基化与基因转录激活

本研究针对当前表观遗传编辑技术依赖复杂基因递送系统的瓶颈问题，开发了基于重组融合蛋白的靶向DNA去甲基化新策略。研究人员通过锌指蛋白阵列(ZFA)和dCas9-gRNA系统分别构建TDG/Tet1CD融合蛋白，经气道给药成功实现小鼠肺上皮细胞Cxc/11启动子特异性去甲基化，显著增强干扰素(IFN)刺激下的基因转录响应。该技术摆脱了病毒载体和转基因依赖，为表观遗传治疗提供了全新路径。

　　

基因表达的精准调控一直是生命科学领域的圣杯。传统基因治疗面临病毒载体容量限制、插入突变风险等挑战，而新兴的表观遗传编辑技术通过修饰DNA甲基化等表观标记，为基因调控提供了新思路。然而现有技术大多依赖病毒载体或mRNA递送系统，存在免疫原性、转染效率低等问题。更关键的是，这些方法往往导致基因持续高表达，缺乏生理环境下的精细调控能力。针对这些瓶颈，罗德岛医院外科研究部的Naohiro Yano、Mohankumar Ramar、David J. Gregory和Alexey V. Fedulov团队在《TRENDS in Biotechnology》发表创新研究，开发了无需载体的靶向表观遗传编辑技术。

研究人员采用两种关键技术：一是基于锌指蛋白阵列(ZFA)与胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)/TET1催化结构域(Tet1CD)的融合蛋白，利用锌指蛋白固有的细胞穿透能力；二是dCas9系统结合超电荷肽(SCP)和核定位信号(NLS)，通过预组装的核糖核蛋白复合体实现递送。使用BALB/c小鼠和MLE12/3T3细胞系，通过气道给药和细胞实验验证技术效果。

Intranuclear staining in vitro and in vivo
免疫荧光和Western blot证实，无论是ZFA还是dCas9融合蛋白，都能在体外培养细胞和小鼠肺上皮细胞核内有效富集。核内组蛋白H3共定位显示，给药24小时后蛋白仍保持活性。

In vitro effects of vector-free epigenetic editor fusion proteins
靶向CXCL11启动子的编辑蛋白使3T3和MLE12细胞特定CpG位点甲基化降低15-30%，且TDG与Tet1CD协同作用使IFNγ刺激下的基因表达提升显著。值得注意的是，单次给药效果可持续3周，且不影响细胞活力。

In vivo effects of vector-free epigenetic editor proteins administered via the airways
小鼠气道给药实验显示，ZFA和dCas9系统均能特异性降低肺上皮细胞CXCL11启动子甲基化，使IFNγ刺激下的转录响应提升3-5倍。远程对照区域未受影响，证实编辑的位点特异性。

Assessment of off-target effects in vivo
全转录组分析表明，dCas9系统特异性达99.5%，ZFA系统为97.6%。虽然存在少量脱靶，但多数可能与CXCL11上调的次级效应有关。

这项研究首次证明无需载体和转基因的表观遗传编辑在体内的可行性。与病毒载体相比，蛋白直接递送避免了插入突变风险，且效果可控；与mRNA相比，减少了免疫刺激和肝脏趋向性问题。技术突破在于：① 实现TDG与Tet1CD协同去甲基化；② 证实锌指蛋白自主递送能力；③ 建立气道给药的蛋白递送方案。研究不仅为肺纤维化等疾病治疗提供新思路（CXCL11具有抗纤维化作用），更开创了表观遗传编辑的蛋白药物开发路径。未来需优化给药方案、评估长期安全性，并拓展至其他组织递送。这项技术将推动表观遗传学从基础研究向临床治疗的转化，为"表观遗传药物"开发奠定基础。