单链DNA结合蛋白SSB与RPA的核酸链直接转移机制及动态蛋白交换研究揭示基因组稳定性调控新机制

本研究通过单分子荧光共振能量转移(smFRET)技术，揭示了单链DNA结合蛋白SSB和RPA在核酸代谢中的动态行为机制。研究人员系统阐明了这两种蛋白在DNA/RNA链间直接转移的动力学特征，发现其通过三元中间体实现高效转移，且转移速率受核酸长度显著影响。研究首次证实SSB与RPA可相互替换结合核酸，并发现二者对RNA的结合能力及其在DNA-RNA竞争中的偏好性，为理解基因组稳定性维持和RNA代谢调控提供了重要分子机制。成果发表于《Nucleic Acids Research》。

　　

在生命活动中，DNA时刻面临着解链与损伤的风险。单链DNA结合蛋白(SSB)和复制蛋白A(RPA)如同基因组"守护者"，通过包裹裸露的单链DNA(ssDNA)防止其降解或形成有害二级结构。然而这些蛋白如何在复制叉快速移动时实现动态重定位？当DNA与RNA并存时它们如何抉择？这些关键机制长期困扰着科学家。

波士顿儿童医院联合约翰斯·霍普金斯大学等机构的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表突破性成果。通过创新性的单分子荧光技术，首次捕捉到SSB/RPA在核酸链间"空中飞人"般的转移过程，揭示其通过瞬时三元复合物实现"零接触"交换的分子芭蕾。更令人惊讶的是，本不相干的细菌SSB与真核RPA竟能互相替换，而它们对RNA的"兼职"结合能力为理解核酸代谢交叉调控打开新视野。

研究主要采用单分子荧光共振能量转移(smFRET)技术，通过设计不同长度的荧光标记DNA/RNA底物，实时观测蛋白结合构象变化。利用微流控成像室实现溶液交换控制，结合交替激光激发排除背景干扰。通过高斯拟合分析FRET效率分布，定量测定结合动力学参数。

【SSB结合和ssDNA直接转移动力学】
研究发现SSB在300 mM NaCl条件下以(SSB)₆₅模式结合dT₇₀，形成高FRET(~0.8)复合物。加入竞争性dT₆₀后，转移速率呈现浓度依赖性(6.1×10⁴ M^-1s^-1)，且在dT₅₅-dT₆₀区间出现速率跃迁。

【RPA结合和ssDNA直接转移动力学】
RPA结合使dT₄₀的FRET降至~0.1，反映其伸展ssDNA的特性。转移速率(8.6×10⁴ M^-1s^-1)在dT₂₀-dT₃₀区间发生显著提升，提示20 nt为最小功能结合单元。

【实时转移途径】
通过Cy3标记竞争链捕捉到瞬时结合事件，SSB和RPA平均分别经历0.31s和0.27s的"尝试-失败"循环才完成转移，证实三元中间体存在。

【蛋白交换动力学】
SSB同源交换速率(4.8×10⁵ M^-1s^-1)在长链ssDNA上效率更高(90% vs 60%)，而RPA交换不受长度影响(~75%)。异源交换实验显示SSB与RPA可相互取代，揭示非特异性置换机制。

【RNA结合与转移】
SSB结合U₅₀形成中FRET(~0.6)复合物，转移速率2.1×10⁴ M^-1s^-1。RPA则意外形成高FRET(~0.8)复合物，速率达4.3×10⁴ M^-1s^-1，提示二者RNA结合构象差异。

【DNA-RNA竞争结合】
在共存体系中，10 μM RNA仍不能置换DNA结合蛋白，而微量DNA即可完全取代RNA复合物，证实二者对DNA的绝对偏好。

该研究建立了ssDNA结合蛋白动态调控的定量框架：首先阐明直接转移通过"碰撞-尝试-锁定"的三步机制完成，其效率受核酸长度非线性调控；其次揭示蛋白交换不依赖特定相互作用，而是通过"结合位点抢占"实现；最后发现RNA结合能力为SSB/RPA参与转录偶联修复提供结构基础。这些发现不仅解释了复制叉处蛋白快速更替的谜题，还为理解R环调控、端粒维持等过程提供新视角。特别值得注意的是，细菌SSB与真核RPA的"跨界"互换能力，暗示了核酸结合蛋白进化的深层保守原理，为设计人工核酸结合蛋白提供蓝图。