RhoBAST RNA适配体通过环开放机制激活荧光的结构基础解析

本研究揭示了RhoBAST RNA适配体与螺环化罗丹明染料相互作用的分子机制。研究人员通过X射线晶体学解析了RhoBAST与5-TAMRA和MaP555的复合物结构，发现四向螺旋连接结构介导的独特结合口袋能稳定染料的开放构象，关键碱基G31与染料3位基团的相互作用是荧光激活的核心机制。该研究为开发新一代基于环开放机制的荧光RNA标记工具提供了重要结构指导。

　　

在活细胞中实现RNA分子的实时成像一直是分子生物学领域的重要挑战。传统的MS2-MCP系统虽然广泛应用，但存在背景信号高、标记体积大等固有缺陷。作为替代方案，荧光RNA适配体因其小分子特性备受期待，但现有适配体大多采用扭曲分子内电荷转移(TICT)或接触淬灭(contact quenching)机制，在性能上仍难以超越蛋白质标记系统。近年来，利用罗丹明染料的螺环化(spirocyclization)特性开发的新型荧光适配体展现出独特优势——这类染料存在荧光型两性离子(zwitterionic)状态与非荧光型螺环(spirocyclic)状态的平衡，适配体通过稳定开放构象实现荧光激活。

科罗拉多大学博尔德分校的研究团队聚焦于性能优异的RhoBAST适配体，该适配体源自能结合磺基罗丹明B(sulforhodamine B)的SRB-2适配体，经定向进化后对螺环化染料SpyRho555展现出纳摩尔级亲和力。为阐明其荧光激活机制，研究人员通过X射线晶体学解析了RhoBAST与两种染料的复合物结构，相关成果发表在《Nucleic Acids Research》。研究采用的主要技术包括：结晶学方法解析2.1?分辨率的RhoBAST:5-TAMRA复合物结构（通过铱单波长反常散射法获得相位）和RhoBAST:MaP555复合物结构（分子置换法解析）；荧光结合实验测定不同突变体的解离常数(K_D)；化学探针(NMIA)和核酸酶(RNase I/T1)足迹法验证溶液构象；光谱分析表征染料结合前后的吸收/发射特性变化。

结构分析部分首先揭示了出人意料的发现：预测的三向连接实际形成了完美的四向螺旋连接(4HJ)。P1与P3螺旋共轴堆积，P2与J2/3共轴堆积，两对螺旋呈反平行排列，这种构型与发夹核酶(hairpin ribozyme)相似。连接处由四个Watson-Crick-Franklin(WCF)碱基对定义，其中J2/3仅含单个WCF对(U14-A20)，这种简约设计与鸟嘌呤核糖开关(guanine riboswitch)相似但形成外周结合口袋。镁离子非依赖性实验表明，高浓度单价离子即可支持RNA折叠，说明4HJ架构具有固有稳定性。

在结合口袋的构建方面，J2/3与L3通过精妙的三级相互作用网络形成结合位点。两个WCF对(G15-C36和G19-C27)连接两个环区，G18-A35-A28形成II型A小调(type II A-minor)三重结构。尤为关键的是，三个腺嘌呤(A16-A34-A29)构成"三腺嘌呤地板"，染料的呫吨核心(xanthene core)通过π-π堆积置于其上。另一侧，G31的WCF面与染料的3位基团形成氢键：在5-TAMRA结构中与羧酸基作用，在MaP555（SpyRho555类似物）中则与硫酰胺基的羰基和硫氧原子作用。G31突变实验证实该位点至关重要，G31A和G31C突变分别使亲和力降低>430倍和>640倍。

通过比较两种染料复合物结构，研究人员提出了RhoBAST的荧光激活机制。虽然5-TAMRA和6-TAMRA在溶液中主要呈开放态，结合后仍出现吸收红移(bathochromic shift)和荧光增强，说明RNA环境可进一步优化染料的光物理性质。而SpyRho555在溶液中存在明显的螺环-两性离子平衡，结合后吸收增加2.5倍，荧光增强4.3倍，表明RhoBAST能有效稳定开放构象。对接分析显示，闭合态SpyRho555也能结合适配体，暗示G31可能直接参与促进环开放的催化过程，类似于金属离子介导的螺环开环机制。

这项研究不仅阐明了RhoBAST适配体的结构基础，更为理性设计新型荧光RNA标签提供了蓝图。四向连接支架的稳定性使其成为"支架化"(scaffolded)体外筛选的理想平台，可通过改造外周环区开发性能更优的变体。G31与3位基团的相互作用模式为设计新型螺环化染料提供了明确方向，而揭示的环开放机制可能普遍适用于其他荧光适配体系统。这些发现将推动RNA成像技术向更高灵敏度、更低背景的方向发展，为研究RNA代谢动力学提供更强大的工具。