基于人工智能分析软件的斑马鱼肥胖原测试优化方案：肥胖原与抗肥胖原的高通量筛选新策略

为解决环境内分泌干扰物(EDs)导致的肥胖问题，法国波尔多大学团队开发了优化版斑马鱼肥胖原测试(ZOT)方案。该研究通过改进斑马鱼饲养条件、尼罗红(NR)染色和深度学习软件(ZOTAS)，实现了对白色脂肪组织(WAT)变化的精准定量，为筛查影响脂肪细胞肥大/萎缩的化合物提供了灵敏可靠的脊椎动物模型。

　　

随着全球肥胖大流行的加剧，科学家们逐渐认识到除饮食和生活方式外，环境中的内分泌干扰物(EDs)作为"肥胖原"(obesogens)通过干扰脂肪代谢加剧了这一危机。这类化学物质广泛存在于食品包装、化妆品和农药中，能通过核受体信号通路促进脂肪细胞肥大(hypertrophy)和增生(hyperplasia)。传统哺乳动物模型成本高、周期长，而斑马鱼(Danio rerio)因其与人类保守的脂代谢机制和透明的幼体特性，成为研究脂肪动态的理想脊椎动物模型。

法国波尔多大学和雷恩大学的研究团队在《Biology Methods and Protocols》发表了优化版斑马鱼肥胖原测试(ZOT)方案。该研究通过系统改进饲养条件、脂肪染色方法和人工智能分析系统，建立了一套特异性强、灵敏度高的标准化流程，为环境污染物和药物的肥胖效应评估提供了创新工具。

研究主要采用三项关键技术：1) 标准化斑马鱼幼体(8.5-9.5 mm SL)饲养体系，通过特定粒径饲料和蛋黄强化喂养控制营养状态；2) 优化尼罗红(Nile red, NR)染色方案(0.1 μg/mL, 0.25%丙酮)，实现脂肪滴的高重现性标记；3) 开发ZOT分析软件(ZOTAS)，应用卷积神经网络(CNNs)自动识别肛鳍皮下脂肪组织(AFRSAT)和腹侧皮下脂肪组织(VSAT)，实现脂肪面积和荧光强度的精准定量。

【研究结果】

1. 饲养方案优化：建立阶梯式喂养策略，5-15日龄使用<100 μm颗粒饲料与蛋黄混合喂养，16日龄后改用100-200 μm标准饲料(SD)，显著提高幼体生长均一性。

2. 染色条件改进：将NR工作液浓度从2 mg/mL降至0.1 μg/mL，染色时间从30分钟缩短至10分钟，有效避免过度染色和颗粒形成，背景变异系数<2%。

3. 脂肪亚定位选择：确定AFRSAT和VSAT作为标准观测位点，相比全鱼脂肪定量，这两个区域在相同焦平面即可完成成像，操作效率提升60倍。

4. ZOTAS验证：深度学习模型对AFRSAT识别的验证损失仅0.1547，与人工ImageJ分析结果高度相关(r=0.98)，处理速度达2秒/样本，错误率<2.35%。

5. 应用案例展示：

   • 高脂饮食(HFD)实验证实0.05 mg/mL蛋黄粉可使AFRSAT面积增加7.9倍
   • 50 nM三丁基锡(TBT)和10 μM罗格列酮(RGZ)均显著抑制禁食导致的脂肪减少
   • 0.1% DMSO浓度验证为最佳溶剂条件，不影响测试灵敏度

【结论与意义】
该研究建立的ZOT方案通过三大创新点解决了传统方法的局限性：1) 采用配对测量设计(paired measurement)有效克服个体脂肪量初始变异；2) 选择特定脂肪亚区实现高重现性成像；3) 人工智能分析确保高通量筛查的准确性。实验证实AFRSAT面积变化与全鱼甘油三酯含量高度一致，且在不同实验室(波尔多UB品系 vs 雷恩AB品系)间具有良好重复性。

这项技术为环境风险评估提供了重要工具，能够快速识别通过核受体(如PPARγ)途径干扰脂代谢的化合物。未来可整合入OECD测试指南，形成从化学品筛查到机制研究的完整技术链条。研究者特别指出，该方法目前主要检测脂肪细胞肥大效应，对涉及脂肪增生的长期效应需结合其他模型补充验证。

研究团队开发的ZOTAS软件已开放下载，其采用的U-Net架构和Li阈值算法为生物图像分析提供了新思路。这项工作也是欧盟"OBERON"项目的重要成果，为理解环境因素与代谢疾病的关系提供了标准化研究范式。