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基于双Cas12a与分裂crRNA协同系统的肺癌相关抗原mRNA疫苗高灵敏度检测新方法
《Biosensors and Bioelectronics》:Highly sensitive detection mRNA vaccine of lung cancer associated antigen by double Cas12a with split crRNA collaborative system
【字体: 大 中 小 】 时间:2025年07月03日 来源:Biosensors and Bioelectronics 10.7
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本研究针对肿瘤mRNA疫苗临床应用中亟需的实时监测需求,创新性地开发了基于分裂crRNA(S-crRNA)的双Cas12a系统耦合滚环扩增(RCA)技术,实现了肺癌疫苗mRNA的超敏检测(0.2 pM)。通过RCA一级信号放大与双Cas12a协同二级放大,解决了长链DNA易折叠的难题,为mRNA疫苗药效评估与药代动力学研究提供了新工具。
肺癌作为全球高死亡率恶性肿瘤,非小细胞肺癌(NSCLC)占比高达85%。尽管手术、靶向治疗等手段不断进步,但mRNA疫苗因其安全性和可编程性成为免疫治疗新星。这类疫苗通过编码肿瘤抗原激活免疫系统,但临床应用中面临关键挑战:如何实时监测疫苗mRNA水平以评估药效?传统RT-PCR需RNA提取且步骤繁琐,而单CRISPR/Cas12a系统仅适用于DNA检测,现有技术均无法满足需求。
针对这一瓶颈,中国研究人员在《Biosensors and Bioelectronics》发表创新成果。他们巧妙结合滚环扩增(RCA)与分裂crRNA(S-crRNA)技术,构建双Cas12a协同检测系统。关键技术包括:1)以肺癌抗原survivin mRNA为靶标设计RCA环形模板;2)开发三片段分裂crRNA结构(含保守rRNA与可变sRNA1/sRNA2);3)建立"一锅法"反应体系实现两级信号放大。
Sensing principle
研究团队设计"触发-扩增-识别"级联机制:靶mRNA触发RCA产生长单链DNA产物(一级放大);相邻位点结合的双Cas12a/split crRNA复合物物理拉伸DNA链,减少二级结构干扰,通过协同反式切割活性实现二级放大。无靶标时RCA无法启动,确保特异性。
Chemicals and reagents
实验采用Phi29 DNA聚合酶进行RCA,Lba Cas12a(来源于Lachnospiraceae bacterium)作为核心酶,通过优化缓冲体系(含Mg2+、dNTPs)实现高效扩增。所有寡核苷酸序列均经PAGE纯化。
Conclusion
该研究突破传统crRNA设计局限,首次实现:1)0.2 pM超高灵敏度,0-100 pM线性检测范围;2)双Cas12a协同识别使信号强度提升3.8倍;3)一锅法操作简化流程。为mRNA疫苗的实时药效监控、个性化剂量调整及新型疫苗筛选提供了革命性工具,推动肿瘤免疫治疗精准化发展。
讨论
相比传统方法,该技术优势显著:1)直接检测mRNA无需反转录;2)split crRNA设计降低脱靶风险;3)双Cas12a协同作用突破单系统检测局限。未来可通过优化crRNA片段长度、引入更多Cas蛋白变体进一步提升多重检测能力。这项研究为CRISPR诊断技术在RNA领域的应用开辟了新范式。