双通道微型显微镜实现自由行为小鼠双色同步成像技术突破及其在海马空间编码研究中的应用

为解决传统微型显微镜仅能单波长成像的局限，加州大学洛杉矶分校团队开发出开源双通道微型显微镜，通过双CMOS传感器设计实现GCaMP与dTomato双色同步成像。该技术成功追踪小鼠海马CA1区神经元跨周动态，证实即使通过dTomato信号进行神经元跨日配准，海马空间编码仍随时间变化。该研究为神经环路多参数成像提供了创新工具，发表于《Science Advances》。

　　

神经科学研究领域长期面临一个重要挑战：如何在自由活动的动物身上同时观测多个神经活动标记物。传统微型显微镜（miniscope）虽能实现单细胞分辨率钙成像，但受限于单通道设计，只能记录单一荧光波长信号。随着基因编码荧光探针的快速发展，科学家们迫切需要能同步捕捉多波长信号的技术，以揭示不同神经群体间的协同机制。特别是在研究海马体空间表征稳定性时，动态钙信号（如GCaMP）与静态细胞标记物（如dTomato）的同步成像，将成为破解"表征漂移"现象的关键。

为突破这一技术瓶颈，加州大学洛杉矶分校Miniscope项目团队基于其第四代微型显微镜（v4版）进行创新，开发出全球首款开源双通道微型显微镜。这项发表于《Science Advances》的研究，通过整合双CMOS传感器和可调焦光学系统，实现了自由行为小鼠的双色同步成像，为神经环路研究开辟了新维度。

研究团队采用三大核心技术：1）双CMOS传感器架构配合分光镜实现物理通道分离；2）滑动校准机制消除梯度折射率（GRIN）透镜带来的色差位移；3）单氰基LED激发双荧光团设计。实验采用10只C57BL/6J雄性小鼠，通过AAV1-hSyn-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato病毒在CA1区共表达GCaMP6f与核定位dTomato，结合1mm直径GRIN透镜植入，在1米线性跑道上进行为期13天的跨日成像。

【双通道微型显微镜设计】
研究团队创新性地将两个PYTHON480 CMOS传感器集成到4.8g的微型化设备中。通过高通透射分光镜将GCaMP（绿色通道）与dTomato（红色通道）发射光分离，配合单波段发射滤光片将通道间串扰控制在7.5%以下。独特的滑动调节机构可补偿GRIN透镜导致的约3.5μm色差位移，确保双通道共焦成像。与单通道显微镜相比，该设计在保持1000×1000μm视野和30fps帧率的同时，实现了双波长同步采集。

【自由行为动物验证】
在体实验显示，佩戴4.8g双通道设备的小鼠仍能达到45.11cm/s的奔跑速度。通过七次跨日成像，研究人员成功追踪到150个CA1神经元，其中46.4%的dTomato标记细胞能在全部实验中稳定检测。值得注意的是，仅22.2%的GCaMP阳性细胞能通过钙信号跨日配准，凸显静态标记通道的必要性。线性回归分析证实通道间串扰系数显著低于理论值（P<0.001），保障了信号采集可靠性。

【海马神经集群稳定性研究】
借助dTomato通道的稳定标记，研究发现：1）即使排除视野不稳定性影响，海马神经元激活率仍随间隔时间延长而下降（斜率-0.0127，P<0.001）；2）空间种群向量（PV）相关性随时间衰减（斜率-0.013，P=0.048）；3）仅19.7%的稳定标记GCaMP细胞能在所有时段保持活性。这些结果证实海马空间编码的时序变化是内在生物学现象，而非技术伪迹。

这项研究通过革命性的双通道成像技术，首次在自由行为动物中实现长时程神经活动与结构标记的同步观测。其创新性体现在三个方面：首先，双CMOS设计突破传统单传感器方案的帧率限制；其次，模块化光学路径为多种荧光团组合成像提供可能；最后，滑动校准机制解决深层成像的色差难题。该技术不仅为海马表征漂移研究提供确凿证据，更为未来研究神经递质释放（如FRET-CNiFERs）、细胞类型特异性活动等开辟新途径。研究团队已公开全部设计资料，这种开放共享模式将加速神经环路研究的创新发展。